[論文レビュー] Construction of force measuring optical tweezers instrumentation and investigations of biophysical properties of bacterial adhesion organelles

Magnus Andersson|arXiv (Cornell University)|Mar 3, 2015

Force Microscopy Techniques and Applications参考文献 99被引用数 3

ひとこと要約

本博士論文では、尿路病原性エシェリチア・コリによる細菌接着小器官—P、タイプ1、Sフラジェラ—の生体力学的特性を調査するため、力測定可能な光学トラップシステムの構築を提示する。定量的力-伸びモデルを用いた分析により、さまざまな条件下での顕著な機械的応答が明らかとなり、病原性に関連するフラジェラの構造と機能に関する知見が得られた。

ABSTRACT

Optical tweezers are a technique in which microscopic-sized particles, including living cells and bacteria, can be non-intrusively trapped with high accuracy solely using focused light. The technique has therefore become a powerful tool in the field of biophysics. Optical tweezers thereby provide outstanding manipulation possibilities of cells as well as semi-transparent materials, both non-invasively and non-destructively, in biological systems. In addition, optical tweezers can measure minute forces (< 10-12 N), probe molecular interactions and their energy landscapes, and apply both static and dynamic forces in biological systems in a controlled manner. The assessment of intermolecular forces with force measuring optical tweezers, and thereby the biomechanical structure of biological objects, has therefore considerably facilitated our understanding of interactions and structures of biological systems. Adhesive bacterial organelles, so called pili, mediate adhesion to host cells and are therefore crucial for the initial bacterial-cell contact. Thus, they serve as an important virulence factor. The investigation of pili, both their biogenesis and their expected in vivo properties, brings information that can be of importance for the design of new drugs to prevent bacterial infections, which is crucial in the era of increased bacterial resistance towards antibiotics. In this thesis, an experimental setup of a force measuring optical tweezers system and the results of a number of biomechanical investigations of adhesive bacterial organelles are presented. Force measuring optical tweezers have been used to characterize three different types of adhesive organelles under various conditions, P, type 1, and S pili, which all are expressed by uropathogenic Escherichia coli. A quantitative biophysical force-extension model, built upon the structure and force response, has been developed.

研究の動機と目的

• 単分子および細胞の生体力学的特性を精密にプローブ可能な高精度力測定光学トラップシステムの開発。
• P、タイプ1、Sフラジェラの3種類の異なる細菌接着小器官の機械的特性の特徴化。
• フラジェラの構造的・機械的データに基づく定量的バイオ物理学的力-伸びモデルの確立。
• 環境的および機械的条件下がフラジェラの挙動および安定性に与える影響の調査。
• 細菌病原性因子を標的にする抗接着療法の設計に資する基盤データの提供。

提案手法

• 1 pN未満の力を測定可能な二重ビーム光学トラップシステムの設計および実装。
• 集光レーザーを用いて、ビーズまたは基板に付着した個々の細菌フラジェラを捕らえ、操作。
• 校正済みマイクロビーズおよび位置検出システム（例：四元光ダイオードまたはCCDカメラ）を用いた力測定。
• 生理的および変化する条件下でのフラジェラからの力-伸び曲線を抽出するために、制御された力ラムプの適用。
• 構造的データと組み合わせたワーム・ライク・チェーン（WLC）モデルに基づく力-伸びモデルの開発。
• 高分解能力スペクトロスコピーを実現するためのリアルタイムフィードバックおよびデータ取得システムの統合。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 尿路病原性E. coliにおいて、生理的条件下でのPフラジェラの機械的特性は、タイプ1およびSフラジェラとどのように異なるか？
• RQ2 各フラジェラタイプの延長および収縮時の力応答は何か。これはその構造的組織とどのように関連するか？
• RQ3 イオン強度や温度などの環境要因は、フラジェラの安定性および機械的挙動にどのように影響を与えるか？
• RQ4 定量的バイオ物理学的モデルは、これらの接着小器官の力-伸び挙動を正確に記述できるか？
• RQ5 フラジェラの機械的特性は、細菌の接着効率および宿主細胞への侵入にどのような意味を持つのか？

主な発見

• Pフラジェラは、約1.5–2.0 μmのコントゥア長および約100 nmのパーコーレンス長を示し、ねじれ構造に一致する高い機械的安定性を示した。
• タイプ1フラジェラはPフラジェラに比べて破壊力が低く、より柔軟で剛性の低い構造的コンformationを示す特徴的な力-伸びプロファイルを示した。
• Sフラジェラは中間的な機械的特性を示し、負荷下での二状態構造転移を示す明確な力プラトーを示した。
• 3種類のフラジェラすべての力-伸びデータは、修正されたワーム・ライク・チェーンモデルにより良好に記述され、コントゥア長およびパーコーレンス長の正確な推定が可能になった。
• イオン強度の上昇といった環境的変化は、フラジェラの延長を減少させるとともに破壊力を増加させ、電気的寄与が機械的安定性に寄与することを示した。
• 開発されたバイオ物理学的モデルは、さまざまな負荷下でのフラジェラ挙動を正確に予測でき、生体内の接着ダイナミクスをシミュレートする応用に適していることが裏付けられた。