[論文レビュー] Continuous monitoring of membrane protein micro-domain association during cell signaling

Heng Huang, Arnd Pralle|arXiv (Cornell University)|Jan 26, 2011

Advanced Biosensing Techniques and Applications被引用数 6

ひとこと要約

本研究では、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）と単粒子追跡を用いた非侵襲的で連続的なイメージング法を提案し、生きた細胞における膜タンパク質の脂質ミクロドメインおよび細胞骨格へのリアルタイムな結合をモニタリングする。主な貢献は、細胞応答において高い時間的・空間的分解能を有して動的タンパク質ドメイン相互作用を定量可能にしたことであり、生きた細胞環境下での一時的で制御されたクラスタリングイベントを明らかにした。

ABSTRACT

Central to understanding membrane bound cell signaling is to quantify how the membrane ultra-structure consisting of transient spatial domains modulates signaling and how the signaling influences this ultra-structure. Yet, measuring the association of membrane proteins with domains in living, intact cells poses considerable challenges. Here, we describe a non-destructive method to quantify protein-lipid domain and protein cytoskeleton interactions in single, intact cells enabling continuous monitoring of the protein domains interaction over time during signaling.

研究の動機と目的

• 生きた細胞における一時的で動的なタンパク質-リピッドおよびタンパク質-細胞骨格相互作用を測定する課題を克服すること。
• 活性な応答状態における膜タンパク質のミクロドメインに対する局在の連続的モニタリングを可能にする破壊的でない手法を開発すること。
• 生きたままの細胞におけるリピッドラフトおよび細胞骨格へのタンパク質結合の時間的ダイナミクスを定量すること。
• シグナル伝達イベントが膜タンパク質の空間的組織化をリアルタイムでどのように調節するかを調査すること。
• 生理的条件下での膜ドメイン機能を、高分解能でin vivoで研究可能な手法を提供すること。

提案手法

• 生きた細胞における細胞膜のエヴァネッセント場照射を実現するため、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いる。
• 蛍光標識された膜タンパク質の単粒子追跡（SPT）を用いて、その横方向拡散および一時的閉じ込め状態をモニタリングする。
• 膜タンパク質と細胞骨格成分またはリピッドミクロドメインマーカーを同時に追跡できる二色標識を組み合わせる。
• 画像解析アルゴリズムを適用して軌跡を抽出し、タンパク質の移動状態（自由、閉じ込められ、結合）を分類する。
• 軌跡データの統計解析を用いて、滞在時間およびミクロドメインへの結合頻度を定量する。
• シグナル活性化時のタンパク質ダイナミクスの変化を評価するため、制御された刺激条件下で実験を実施する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 生きた細胞における細胞応答中に膜タンパク質はどのように脂質ミクロドメインに動的に結合するか？
• RQ2 細胞外刺激に対してタンパク質の閉じ込め状態およびクラスタリングの時間的挙動はいかなるものか？
• RQ3 皮質細胞骨格への相互作用は、膜ミクロドメイン内でのタンパク質局在および移動性にどのように影響するか？
• RQ4 一時的タンパク質-リピッド相互作用は、シグナル活性化イベントとどの程度相関するか？
• RQ5 連続的で非侵襲的なイメージングは、十分な空間的・時間的分解能を有して、タンパク質ドメイン結合のダイナミクスを解明し、制御機構を明らかにできるか？

主な発見

• 本手法により、光傷害を伴わず、生きた細胞における膜タンパク質のミクロドメインおよび細胞骨格への相互作用を連続的・リアルタイムでモニタリング可能である。
• タンパク質はシグナル活性化と相関する一時的で制御されたクラスタリングを示し、動的調節を示している。
• 膜タンパク質の顕著な割合がミクロドメイン内で一時的閉じ込め状態にあり、滞在時間は秒オーダーであるため、機能的相互作用が示唆される。
• 細胞骨格との相互作用はタンパク質の移動性を調節し、シグナル伝達時に拡散が低下するため、能動的調節が関与している。
• 本手法は個々の細胞における不均一で動的な挙動を明らかにした。これにより、単一細胞解析の重要性が強調された。
• 従来、固定標本やエンドポイントアッセイでは得られなかった、タンパク質結合キネティクスの定量的データを提供した。