[論文レビュー] Correcting a SHAPE-directed RNA structure by a mutate-map-rescue approach

Siqi Tian, Pablo Cordero+2 more|arXiv (Cornell University)|Jan 21, 2014

RNA and protein synthesis mechanisms参考文献 57被引用数 44

ひとこと要約

本研究は、高スループットマルチプレーション、SHAPEマッピング、機能的レスキューを組み合わせたミューテート・マップ・レスキュー法を用いて、以前に誤って推定されたリボソームRNAのコンformational変化を是正した。この手法により、近似結晶構造精度に近い精度で16S rRNAドメインの真の二次構造が特定され、1つのヌクレオチドのレジスターシフトによってアクセス可能な機能的に重要な一時的コンformational状態が同定された。これは、以前のSHAPEベースの誤解を是正するものである。

ABSTRACT

The three-dimensional conformations of non-coding RNAs underpin their biochemical functions but have largely eluded experimental characterization. Here, we report that integrating a classic mutation/rescue strategy with high-throughput chemical mapping enables rapid RNA structure inference with unusually strong validation. We revisit a paradigmatic 16S rRNA domain for which SHAPE (selective 2`-hydroxyl acylation with primer extension) suggested a conformational change between apo- and holo-ribosome conformations. Computational support estimates, data from alternative chemical probes, and mutate-and-map (M2) experiments expose limitations of prior methodology and instead give a near-crystallographic secondary structure. Systematic interrogation of single base pairs via a high-throughput mutation/rescue approach then permits incisive validation and refinement of the M2-based secondary structure and further uncovers the functional conformation as an excited state (25+/-5% population) accessible via a single-nucleotide register shift. These results correct an erroneous SHAPE inference of a ribosomal conformational change and suggest a general mutate-map-rescue approach for dissecting RNA dynamic structure landscapes.

研究の動機と目的

• 16S rRNAドメインのSHAPE由来のRNA構造に生じる矛盾を解消すること。
• 実験的マルチプレーションと機能的レスキューを用いて、以前に提案されたリボソームコンformational変化を検証および精緻化すること。
• 動的RNA構造ランドスケープを高精度にプローブする一般化可能な手法を開発すること。
• 観察された16S rRNAのコンformational変化が安定した構造的特徴であるか、それとも一時的で低頻度の状態であるかを特定すること。

提案手法

• 16S rRNAドメイン内の個々の塩基対を体系的に破壊するための高スループットマルチプレーションの応用。
• 変異体構造におけるRNAの柔軟性と構造的変化をマッピングするためのSHAPE化学的プロービングの使用。
• 突然変異の表現型への影響を評価し、構造モデルを検証するための機能的レスキューアッセイ。
• ミューテート・アンド・マップ（M2）データを計算モデルと統合し、二次構造を推定する。
• M2由来の構造を、他の化学的プローブのデータおよび結晶構造のリファレンスと比較する。
• 変異体集団の定量的分析により、一時的コンformational状態の割合を推定する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 16S rRNAドメインにおけるSHAPE由来のコンformational変化は、安定した構造的遷移であるか、それとも一時的で低頻度の状態であるか？
• RQ2 体系的なミューテート・マップ・レスキューアプローチは、SHAPEデータからのRNA構造推定の誤りを是正できるか？
• RQ3 機能的および化学的プロービングによって検証された真の16S rRNAドメインの二次構造は何か？
• RQ4 1つのヌクレオチドのレジスターシフトによって、機能的に重要な一時的コンformational状態にアクセス可能か？

主な発見

• 以前のSHAPEベースのリボソームコンformational変化の推定は誤りであり、その観察された変化はメソドロジカルな制限によるアーティファクトであった。
• ミューテート・マップ・レスキュー法を用いることで、近似結晶構造精度に近い精度で16S rRNAドメインの真の二次構造が特定された。
• 機能的に重要なコンformational状態が、溶液中で25±5％の割合で存在する励起状態として存在することが判明した。
• この励起状態は、RNA配列における1つのヌクレオチドのレジスターシフトによってアクセス可能である。
• ミューテート・マップ・レスキュー法は、M2に基づく二次構造モデルの検証および精緻化に成功した。
• 本研究は、動的で低頻度のRNAコンformational状態が、体系的なマルチプレーションとプロービングを用いることで、機能的に重要かつ検出可能である可能性を示した。