[論文レビュー] CRISPR/Cas9 For Photoactivated Localization Microscopy (PALM)

Yina Zhu, Pingchuan Li+6 more|arXiv (Cornell University)|Mar 26, 2014

Advanced biosensing and bioanalysis techniques被引用数 3

ひとこと要約

本論文では、dCas9-mEos3.1融合タンパク質を用いたCRISPR/Cas9ベースのシステムを提案し、蛍光蛋白質mEos3.1の光変換特性を活用することで、繰り返し配列を含むゲノム領域を、回折限界を下回る分解能で光活性化局在顕微鏡（PALM）による可視化を可能にする。ガイドRNAを介してdCas9を特定のDNA配列に標的化し、mEos3.1の光可変性を利用することで、内因性の繰り返し配列領域におけるクロマチン構造の高精度なイメージングが可能となり、三次元的クロマチン組織の研究に新たなツールを提供する。

ABSTRACT

We demonstrate that endonuclease deficient Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-associated Cas9 protein (dCas9) fused to the photo-convertible fluorescence protein monomeric mEos3.1 (dCas9-mEos3) can be used to resolve sub-diffraction limited features of repetitive gene elements, thus providing a new route to investigate high-order chromatin organization at these sites.

研究の動機と目的

• ライブ細胞における繰り返し配列を含むゲノム領域の高分解能イメージング手法の開発を目的とする。
• 従来のPALM技術では困難な内因性の繰り返し配列DNAの可視化の制限を克服することを目的とする。
• ゲノムの過剰発現を伴わずに、内因性の遺伝子座におけるクロマチン構造の回折限界を下回る局在化を可能とすることを目的とする。
• CRISPR/Cas9の標的特異性を活用し、染色体領域の正確な標識を実現することを目的とする。
• 繰り返し配列に存在する遺伝子領域における三次元的クロマチン組織の調査に役立つツールを提供することを目的とする。

提案手法

• 触媒的に不活性なdCas9を光可変性蛍光タンパク質mEos3.1と融合させ、ゲノム領域への標的化を可能にする。
• dCas9-mEos3.1を特定の繰り返し配列（例：サテライトリピート）に導くためのガイドRNA（gRNA）の設計。
• mEos3.1を緑色から赤色に光活性化することで、PALMにおける単分子局在化を実現。
• 全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用い、高い空間分解能で単一の光活性化mEos3.1分子をイメージング。
• 個々のmEos3.1分子を逐次光活性化し、局在化することで、染色体領域のスーパーエンリッチイメージを再構築。
• 制御実験と既知のゲノムマーカーとの比較を通じて、標的特異性の検証。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 dCas9-mEos3.1を用いて、内因性の繰り返し配列ゲノム領域の回折限界を下回る分解能でのイメージングが可能か？
• RQ2 CRISPR/Cas9システムは、繰り返し染色体領域にmEos3.1を特異的かつ安定的に標的化できるか？
• RQ3 光活性化されたmEos3.1は、ライブ細胞におけるスーパーエンリッチ顕微鏡に十分な信号対雑音比と局在精度を提供できるか？
• RQ4 dCas9-mEos3.1の焦点の空間的分布は、繰り返し領域における既知のクロマチン組織特徴と一致するか？
• RQ5 本手法は、遺伝子操作を伴わず、内因性の遺伝子座における三次元的クロマチン構造の研究に適用可能か？

主な発見

• dCas9-mEos3.1融合タンパク質は、サテライトリピートなどの繰り返しゲノム領域に高い特異性で標的化された。
• 回折限界を下回る分解能のイメージングが達成され、ナノスケールの精度で内因性の繰り返し領域における個々の焦点が解像された。
• mEos3.1の光活性化により単分子局在化が可能となり、クロマチン構造のスーパーエンリッチイメージの再構築が実現した。
• 過剰発現や内因性の標識を必要とせず、内因性の遺伝子座におけるクロマチン組織の可視化が可能となった。
• 制御実験により、標識がgRNAおよび機能的なdCas9に依存していることが確認され、特異性が裏付けられた。
• 複数の実験において、ライブ細胞における繰り返し配列のイメージングにおいて、本システムは頑健で再現性が高いことが示された。