[論文レビュー] Cryopreservation of sugarcane embryogenic callus using a simplified freezing process

Marcos Edel Martínez-Montero, María Teresa González-Arnao+3 more|arXiv (Cornell University)|Aug 21, 2020

Plant tissue culture and regeneration被引用数 10

ひとこと要約

本研究では、10% DMSOおよび0.3–0.75Mスクロース前処理を施した後、0.4–0.6°C/minのゆっくり冷却を-40°Cまで行い、液体窒素に保存する制御冷却プロセスを用いて、サトウキビの胚性クロラムの簡素化された凍結保存法を開発した。この方法により、最大94%の生存率と完全なプラントレット再生が達成され、14か月間の保存後も安定した生存率を示した。

ABSTRACT

A simplified freezing process was developed and successfully applied to embryogenic calluses of three sugarcane commercial hybrids (Saccharum sp. cv. CP 5243, C 91-301 and C 1051-73). To obtain optimal survival, the calluses were pretreated with a cryoprotective solution containing 10% DMSO and 0.3 to 0.75M sucrose. For freezing, the samples were immersed in an alcohol bath placed in a -40 degrees C freezer, thus allowing a freezing rate comprised between 0.4 and 0.6 degrees C/min. Samples were held at that temperature for 2 h before immersion in liquid nitrogen. The highest survival rates of cryopreserved calluses ranged between 20 and 94% depending on the variety, and fully developed plantlets could be obtained from regenerating calluses. Embryogenic calluses of one variety were stored for 14 months in liquid nitrogen without any effect on their survival rate and plantlet production.

研究の動機と目的

• サトウキビの胚性クロラムの長期ゲノムバンク保存を改善するため、簡素化された凍結保存法を開発すること。
• 凍結保護前処理としてのDMSOおよびスクロース濃度を最適化し、凍結後生存率を向上させること。
• 液体窒素に長期間保存した後の、凍結保存クロラムの生存率および再生能力を評価すること。
• サトウキビ育種プログラムに適したコスト効果的でアクセス可能な凍結法を確立すること。

提案手法

• サトウキビ交雑種3品種（CP 5243、C 91-301、C 1051-73）の胚性クロラムを、10% DMSOおよび0.3–0.75Mスクロースを含む凍結保護液で前処理した。
• 前処理したクロラムを、-40°Cのフリーザー内に浸漬したアルコールバスを用いて、0.4–0.6°C/minの制御冷却速度で冷却した。
• 冷却後、-40°Cで2時間平衡をとらせた後、急速に液体窒素に移して長期保存した。
• 凍結後、クロラムの生存率を評価し、再生可能なクロラムを培養してプラントレット再生能力を評価した。
• 14か月間の液体窒素保存後、長期安定性を評価するために生存率をテストした。
• 再生したプラントレットは形態的評価およびin vitro条件下での生育により確認した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 どの凍結保護剤および濃度の組み合わせが、サトウキビの胚性クロラムの凍結保存後の生存率を最大にするか？
• RQ2 制御冷却速度を用いた簡素化された凍結プロトコルが、サトウキビクロラムの凍結後生存率を高めることができるか？
• RQ3 液体窒素に長期間保存することで、凍結保存したサトウキビの胚性クロラムの生存率および再生能力に影響を与えるか？
• RQ4 異なるサトウキビ品種において、凍結保存した胚性クロラムから完全に発達したプラントレットを再生させることができるか？

主な発見

• テストしたクロラム系統の中で、最高の生存率は1つのサトウキビ交雑種（C 1051-73）で94%に達した。
• 3品種のサトウキビにおいて、生存率は20%から94%の範囲に分布しており、遺伝子型依存の反応が顕著に現れた。
• 1品種の胚性クロラムは、液体窒素に14か月間保存後も完全な生存率と再生能力を維持した。
• 再生したクロラムは、完全に発達したプラントレットを効果的に生成し、凍結保存組織の機能的回復を確認した。
• 10% DMSOおよび0.3–0.75Mスクロースを前処理液として用いることで、凍結保護効率が顕著に向上した。
• -40°Cのフリーザーとアルコールバスを用いた簡素化された凍結法により、0.4–0.6°C/minの一貫した冷却速度が達成され、再現性のある結果が得られた。