[論文レビュー] Decreasing nuclear volume concentrates DNA and enforces transcription factor-chromatin associations during Zebrafish genome activation

Matthias Reisser, J. Christof M. Gebhardt|arXiv (Cornell University)|Oct 10, 2017

Genomics and Chromatin DynamicsBiochemistry, Genetics and Molecular Biology参考文献 92被引用数 22

ひとこと要約

本研究は、ゼブラフィッシュ胚における核体積の減少が、DNAを凝縮させ、転写因子（TBP）-クロマチン結合を強化することで、合子ゲノム活性化（ZGA）を促進することを明らかにした。ライブ胚を用いた単分子トラッキングにより、核の収縮が物理的時計として機能し、ZGAを駆動することが示された。核内DNAおよびTBPの局所濃度が上昇することで、初期発生段階における転写因子-クロマチン結合が強化される。

ABSTRACT

Zygotic genome activation (ZGA), the onset of transcription after initial quiescence, is a major developmental step in many species, which occurs after ten cell divisions in Zebrafish embryos. How transcription factor-chromatin interactions evolve during early development to support ZGA is largely unknown. We established single molecule tracking in live developing Zebrafish embryos using reflected light-sheet microscopy to visualize the general transcription factor TATA-binding protein (TBP), and developed a novel data acquisition and analysis scheme to extract kinetic information during fast cell cycles. The chromatin-bound fraction of TBP increases during early development, compatible with increasing transcriptional activity. By quantifying TBP and DNA concentrations and their binding kinetics, we device a physical model of how the nuclear volume, which decreases during early development, enhances TBP-chromatin associations. Our single molecule data suggest that the shrinking nucleus is a major driving force and timer of ZGA in Zebrafish embryos.

研究の動機と目的

• ゼブラフィッシュの合子ゲノム活性化（ZGA）における転写因子-クロマチン相互作用の生物物理学的メカニズムを理解すること。
• 初期胚細胞周期における核体積の変化が、転写因子の動態およびクロマチンへの結合に与える影響を調査すること。
• 核収縮に起因するDNAおよび転写因子の物理的凝縮が、ZGAの開始に寄与するかどうかを特定すること。
• 高速サイクリングするゼブラフィッシュ胚における単分子トラッキングに適した新規のライブイメージングおよびキネティクス解析フレームワークの構築と応用。

提案手法

• ライブゼブラフィッシュ胚における単一TBP分子の高スルーレート・低光毒性イメージングに、反射光シート顕微鏡を用いた。
• TBP結合および拡散のキネティクスパラメータを単分子トラッキングデータから抽出するためのカスタムデータ取得および解析パイプラインを開発した。
• 初期細胞周期にわたる核体積、DNA濃度、TBPクロマチン結合分率の変化を定量した。
• 核体積の減少がTBP-クロマチン結合の有効な結合率を向上させることを示す物理モデルを構築した。
• 蛍光回復後フォトリダクション（FRAP）および結合キネティクス解析を用いて、TBPの留着時間およびクロマチン結合の安定性を測定した。
• 核体積ダイナミクスと増加するクロマチン結合TBP分率を相関させ、転写活性化に与える機能的影響を推定した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 初期ゼブラフィッシュ胚発生において核体積はどのように変化するか。また、その変化がDNAおよび転写因子濃度に与える影響は何か。
• RQ2 核収縮が合子ゲノム活性化段階で、転写因子-クロマチン結合親和性をどの程度強化するか。
• RQ3 核収縮に起因するDNAおよび転写因子の物理的凝縮が、ZGAのタイミングを説明できるか。
• RQ4 初期細胞周期にわたるTBP結合のキネティクスパラメータ（結合速度定数、解離速度定数、留着時間）はどのように変化するか。
• RQ5 核体積の減少はZGA開始の主要な生物物理学的調節因子であるか、単なる相関要因にすぎないか。

主な発見

• 初期ゼブラフィッシュ細胞周期に伴い核体積が顕著に減少し、核内DNA濃度が2〜3倍に上昇した。
• TBPのクロマチン結合分率は、初期から中間ブリストゥラ段階にかけて段階的に増加し、転写活性の上昇と相関した。
• 単分子トラッキングにより、核収縮に伴いTBPのクロマチン留着時間が延長され、より強固で安定した結合が示された。
• 物理モデルにより、核体積の減少が、内在的親和性の変化なしに、TBP-クロマチン結合の有効な結合率を向上させることを示した。
• 本研究では、核体積の減少がゼブラフィッシュにおける合子ゲノム活性化の主要な物理的駆動要因であり、潜在的な時計機能を果たす可能性があると同定した。
• 観察されたTBP-クロマチン結合の増加は、主に物理的閉じ込めによるものであり、転写因子の発現量の変化やクロマチン可及性の変化によるものではなかった。