[論文レビュー] Design and applications of a fluorescent labeling technique for lipid and surfactant preformed vesicles

Fanny Mousseau, Jean‐François Berret+1 more|arXiv (Cornell University)|Jun 4, 2019

Lipid Membrane Structure and Behavior被引用数 4

ひとこと要約

本論文では、精製や分離工程を要しない、リポフィル性のカルボシアンイン染料PKH67を用いた、事前に形成されたリン脂質および界面活性剤のバイオセンサー膜への普遍的で簡便な蛍光標識技術を提示する。この手法により、生細胞膜や固体表面とのバキュール相互作用をリアルタイムで可視化でき、薬物送達や繊維柔化剤応用において高い特異性と最小限のサンプル撹乱を実現する。

ABSTRACT

Amphiphilic molecules such as surfactants, lipids and block copolymers can be assembled into bilayers and form vesicles. Fluorescent membrane labeling methods require the use of dye molecules that can be inserted in the bilayers at different stages of the synthesis. To our knowledge there is no generalized method for labeling preformed vesicles. Herein we develop a versatile protocol that is suitable to both surfactant and lipid preformed vesicles and requires no separation or purification steps. Based on the lipophilic carbocyanine green dye PKH67, the methodology is assessed on zwitterionic phosphatidylcholine vesicles. To demonstrate its versatility, it is applied to dispersions of anionic or cationic vesicles, such as a drug administrated to premature infants with respiratory distress syndrome, or a vesicle formulation used as a fabric softener for homecare applications. By means of fluorescence microscopy we then visualize the interaction mechanisms of nanoparticles crossing live cell membranes and of surfactant adsorbing on cotton fabric. These results highlight the advantages of a membrane labeling technique that is simple and applicable to a large number of soft matter systems.

研究の動機と目的

• 分離・精製工程を回避する、事前に形成されたバイオセンサー膜に普遍的に適用可能な蛍光標識法の開発を目的とする。
• 生物学的および産業的フォーミュレーションを含む、複雑なソフトマター系におけるバイオセンサー膜の動的挙動の可視化を可能とすること。
• 両性イオン性、陰性イオン性、陽性イオン性の各系を含む多様なバイオセンサー膜タイプへの技術の妥当性を検証すること。
• 新生児呼吸窮 迫症候群の薬物送達や繊維柔化剤応用など、生物学的および産業的文脈における応用可能性を示すこと。
• 蛍光顕微鏡を用いたリアルタイム観察に適した、強固でスケーラブルな標識プロトコルの提供。

提案手法

• リポフィル性のカルボシアンイングリーン染料PKH67を用い、リン脂質および界面活性剤バイレイヤーに自発的に分配させる。
• 事前に形成されたバイオセンサー膜分散液に、事前の精製や分離を経ずにPKH67を直接添加する。
• 膜バイレイヤー内での染料のアンバランスを解消するため、制御された条件下でインキュベートする。
• 蛍光顕微鏡を用いて、標識済みバイオセンサー膜の生細胞膜への移動および表面吸着反応をモニタリングする。
• 表面電荷が異なる（両性イオン性、陰性イオン性、陽性イオン性）バイオセンサー膜にプロトコルを適用し、汎用性を検証する。
• 形態的および蛍光分析による、標識効率とバイオセンサー膜の構造的・機能的安定性への最小限の影響を検証する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 分離・精製工程を要しない、普遍的で効果的なバイオセンサー膜の蛍光標識法を構築できるか？
• RQ2 PKH67は、陰性イオン性および陽性イオン性のバイオセンサー膜に対しても、どの程度効果的に標識できるか？
• RQ3 この標識法は、生物学的および産業的環境下において、バイオセンサー膜の構造的・機能的安定性をどの程度保持できるか？
• RQ4 標識済みバイオセンサー膜を用いて、生細胞膜および固体表面とのリアルタイム相互作用を可視化できるか？
• RQ5 この手法は、薬物送達や家庭用洗剤フォーミュレーションを含む、さまざまなソフトマター系にどの程度広く適用可能か？

主な発見

• PKH67標識法は、両性イオン性、陰性イオン性、陽性イオン性バイオセンサー膜のすべてに対して、精製や分離工程を要せず、効果的に標識できた。
• 蛍光顕微鏡による確認により、効率的かつ安定した標識が達成され、生細胞膜へのバイオセンサー膜相互作用のリアルタイム可視化が可能となった。
• この手法により、ナノ粒子の細胞膜を通過する挙動が直接観察され、エンドサイトーシス経路および非エンドサイトーシス経路の両方が同定された。
• 標識済み界面活性剤バイオセンサー膜は、コットン繊維への効果的な吸着が確認され、家庭用洗剤応用の有効性が示された。
• 蛍光強度および粒子径分布の一定性から、バイオセンサー膜の形態的・機能的安定性が保持されていることが確認された。
• この標識プロトコルは、新生児呼吸窮 迫症候群の薬物フォーミュレーションおよび市販の繊維柔化剤を含む、複数のシステムで妥当性が検証された。