[論文レビュー] Efficient wide-field FLIM

Adam J. Bowman, Brannon B. Klopfer+2 more|arXiv (Cornell University)|Dec 17, 2018

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 52被引用数 12

ひとこと要約

本論文は、ナノ秒時間分解能と高い光子効率を備えたPockelsセルを用いた広視野蛍光寿命イメージング（FLIM）技術を提案する。この技術により、カメラフレームレートで1フレーム分のFLIMが可能となる。Pockelsセルと偏光ビームスプリッター、再像形成キャビティを組み合わせることで、時間相関単一光子計数（TC-SPC）と比較して10³–10⁵倍の高いスループットを実現し、ゲーティング損失のないマルチラベルFLIM、単分子分光法、動的イメージングを可能にする。

ABSTRACT

Nanosecond temporal resolution enables new methods for wide-field imaging like time-of-flight, gated detection, and fluorescence lifetime. The optical efficiency of existing approaches, however, presents challenges for low-light applications common to fluorescence microscopy and single-molecule imaging. We demonstrate the use of Pockels cells for wide-field image gating with nanosecond temporal resolution and high photon collection efficiency. Two temporal frames are obtained by combining a Pockels cell with a pair of polarizing beam-splitters. We show multi-label fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), single-molecule lifetime spectroscopy, and fast single-frame FLIM at the camera frame rate with $10^3 - 10^5$ times higher throughput than single photon counting. Finally, we demonstrate a space-to-time image multiplexer using a re-imaging optical cavity with a tilted mirror to extend the Pockels cell technique to multiple temporal frames. These methods enable nanosecond imaging with standard optical systems and sensors, opening a new temporal dimension for low-light microscopy.

研究の動機と目的

• 既存の広視野ナノ秒イメージング技術における低光量蛍光顕微鏡での低光子効率および低スループットという制限を克服すること。
• 標準的なカメラおよび光学部品を用いて、ナノ秒時間分解能を備えた高感度で広視野FLIMを実現すること。
• 画像品質の劣化やゲーティングアーチファクトを引き起こさずに、死時間のない効率的な方法で単一フレームおよびマルチフレームFLIMを実現すること。
• 再像形成光学キャビティを用いてPockelsセルゲーティング技術を複数の時間フレームに拡張し、時間から空間への多重化を実現すること。

提案手法

• Pockelsセルを用いて、電場に依存する遅延を発生させ、広視野蛍光発光の偏光を変調することで、ナノ秒時間分解ゲーティングを実現する。
• Pockelsセル後のビームを2つの偏光ビームスプリッター（PBS）が分割し、ゲートパルスの前後における時間的強度差を符号化した4つの出力画像を生成する。
• Pockelsセルにステップ関数またはガウスパルスを印加することで2つの時間チャンネルを形成し、2つの出力チャネルの強度比を用いて蛍光寿命を計算する。
• 傾けられたミラーを備えた再像形成光学キャビティを用いて、画像を複数回反射させ、1回の往復時間t_rt = 8f/cでフレーム間隔を決定することで、複数の時間フレームを生成する。
• 本手法は、4.5ナノ秒のリゼーション時間と80％のゲーティング効率を有する30 mmのKD*P Pockelsセルに依存しており、インストゥルメンタル応答関数（IRF）の補正のためのビームスプリッターを用いる。
• 寿命計算には、測定された強度比と事前に特徴付けられたIRFに基づくルックアップテーブルを用い、ショットノイズおよびバックグラウンド寄与を考慮した誤差解析を実施する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 Pockelsセルを用いたシステムは、広視野FLIMにおいて高い光子収率を備えたナノ秒時間分解能を達成できるか？
• RQ2 本技術は、死時間やゲーティング損失なしに、カメラフレームレートで単一フレームFLIMを実現できるか？
• RQ3 再像形成キャビティを用いることで、Pockelsセル法を複数の時間フレームに拡張し、マルチフレーム超高速イメージングを可能にするか？
• RQ4 従来のTC-SPCおよびゲーティングイメージングシステムと比較して、光子効率および信号対ノイズ性能はどの程度か？
• RQ5 視野全体にわたるインストゥルメンタル応答関数の空間的変動が、寿命の正確性にどの程度影響を及えるか？

主な発見

• Pockelsセルシステムは、時間相関単一光子計数（TC-SPC）と比較して10³–10⁵倍の高いスループットを達成し、カメラフレームレートで単一フレームFLIMを実現できる。
• 本手法は、効率的なマルチラベルFLIM、単分子寿命分光法、および死時間やノイズの問題を伴わない動的FLIMを可能にする。
• 4.5ナノ秒のリゼーション時間と80％のゲーティング効率を有する30 mmのKD*P Pockelsセルは、6 mradの半開口角内において高精度な時間分解能を実現できる。
• f = 150 mm、t_rt = 4.0 nsの再像形成キャビティにより、時間から空間への多重化が可能となり、nフレームイメージングが実現され、複数の時間チャンネルに技術が拡張される。
• 寿命測定では、特に広視野において顕著な空間的変動を示すインストゥルメンタル応答関数に起因する位置依存誤差が生じるが、解析段階で補正が行われる。
• Cramér-Rao境界解析により、本手法がほぼ最適な光子効率を達成していることが確認され、正規化された不確実性は時間チャンネル数および積分時間の増加に伴い有利に変化する。