[論文レビュー] Estimation of genome size using k-mer frequencies from corrected long reads

Hengchao Wang, Bo Liu+7 more|arXiv (Cornell University)|Mar 26, 2020

Genomics and Phylogenetic Studies参考文献 18被引用数 12

ひとこと要約

この論文は、補正済みの第3世代長時間読み取りシーケンシングデータ（例：PacBio、Nanopore）を用いたk-mer頻度解析によって、第二世代のIlluminaデータを必要とせずにゲノムサイズを信頼性高く推定できることを示している。著者らは、補正済みの長時間読み取りデータにおいて正確なk-merカウントを可能にする軽量なC/C++ツールkmerfreqを提案し、コスト効率の高い単一技術のゲノミクスプロジェクトを実現している。

ABSTRACT

The third-generation long reads sequencing technologies, such as PacBio and Nanopore, have great advantages over second-generation Illumina sequencing in de novo assembly studies. However, due to the inherent low base accuracy, third-generation sequencing data cannot be used for k-mer counting and estimating genomic profile based on k-mer frequencies. Thus, in current genome projects, second-generation data is also necessary for accurately determining genome size and other genomic characteristics. We show that corrected third-generation data can be used to count k-mer frequencies and estimate genome size reliably, in replacement of using second-generation data. Therefore, future genome projects can depend on only one sequencing technology to finish both assembly and k-mer analysis, which will largely decrease sequencing cost in both time and money. Moreover, we present a fast light-weight tool kmerfreq and use it to perform all the k-mer counting tasks in this work. We have demonstrated that corrected third-generation sequencing data can be used to estimate genome size and developed a new open-source C/C++ k-mer counting tool, kmerfreq, which is freely available at https://github.com/fanagislab/kmerfreq.

研究の動機と目的

• デノボアセンブリプロジェクトにおけるゲノムサイズ推定において、第二世代シーケンシングデータへの依存を排除すること。
• 第3世代プラットフォームから得られる補正済み長時間読み取りデータが、正確なk-mer頻度解析を可能にするかを評価すること。
• 長時間読み取りデータに適した高速で軽量なk-merカウントツールの開発。
• 単一技術（第3世代のみ）のゲノミクスワークフローが、ゲノムサイズ推定に実用的であることを実証すること。

提案手法

• PacBioおよびNanoporeプラットフォームの補正済み長時間読み取りデータを、k-mer頻度解析の入力として使用した。
• 長時間読み取りデータセットにおけるk-mersを効率的にカウントするためのカスタムC/C++ツールkmerfreqを開発した。
• k-mer頻度分布のピークを分析することでゲノムサイズを推定し、ヒストグラムに現れる特徴的な「膝」（knee）を利用した。
• このアプローチでは、ゲノム内の大部分のk-mersがユニークまたは低頻度で出現すると仮定し、分布のモードが単倍体ゲノムの期待されるk-mer頻度に対応するとする。
• 次の式を用いる：ゲノムサイズ ≈ （k-mers総数）／（ピークk-mers頻度）、シーケンシング深度およびエラー補正の影響を補正した。
• 複数の種において、補正済み長時間読み取りデータとIlluminaベースの推定値を比較して、性能を検証した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 補正済みの第3世代長時間読み取りデータは、ゲノムサイズ推定に適した明確なk-mer頻度分布を生成できるか？
• RQ2 第二世代シーケンシングデータを補正済み長時間読み取りデータに置き換えることは、k-merベースのゲノミクス解析において可能か？
• RQ3 補正済み長時間読み取りデータからのk-mer頻度を用いたゲノムサイズ推定は、従来の手法と比較してどの程度正確か？
• RQ4 長時間読み取りデータに特化した、軽量で効率的なk-merカウントツールを開発することは可能か？

主な発見

• 補正済み長時間読み取りデータは明確なピークを持つk-mer頻度分布を生成し、正確なゲノムサイズ推定を可能にした。
• 補正済み長時間読み取りデータからのゲノムサイズ推定値は、Illuminaデータから得られた基準値と高い一致を示した。
• kmerfreqツールは高い処理速度と低メモリ使用量を達成し、大規模なゲノミクス応用に適していた。
• 本研究では、第二世代シーケンシングを必要としない単一技術（第3世代のみ）のワークフローが、信頼性高くゲノムサイズを推定できることを実証した。