[論文レビュー] Exploiting speckle correlations to improve the resolution of wide-field fluorescence microscopy

Hasan Yılmaz, E.G. van Putten+4 more|University of Twente Research Information|Oct 8, 2014

Random lasers and scattering media参考文献 28被引用数 55

ひとこと要約

本論文では、ガリウムホスファイト散乱レンズからのスパーキルパターンを用いて、広視野蛍光顕微鏡において回折限界未満の分解能を達成する、スパーキル相関分解能向上（SCORE）という手法を紹介する。複数の傾けられたビーム入射角におけるスパーキル照明の相関を活用することで、波面整形や複雑なキャリブレーションを必要とせず、10×10 µm²の視野において130 nmの復元分解能を実現する。

ABSTRACT

Fluorescence microscopy is indispensable in nanoscience and biological sciences. The versatility of labeling target structures with fluorescent dyes permits to visualize structure and function at a subcellular resolution with a wide field of view. Due to the diffraction limit, conventional optical microscopes are limited to resolving structures larger than 200 nm. The resolution can be enhanced by near-field and far-field super-resolution microscopy methods. Near-field methods typically have a limited field of view and far-field methods are limited by the involved conventional optics. Here, we introduce a combined high-resolution and wide-field fluorescence microscopy method that improves the resolution of a conventional optical microscope by exploiting correlations in speckle illumination through a randomly scattering high-index medium: Speckle correlation resolution enhancement (SCORE). As a test, we collect two-dimensional fluorescence images of 100-nm diameter dye-doped nanospheres. We demonstrate a deconvolved resolution of 130 nm with a field of view of 10 x 10 $ ext{μm}^2$.

研究の動機と目的

• 走査プローブや特殊な染料を必要としない、簡単でハードウェアフリーな方法により、広視野蛍光顕微鏡における回折限界を克服すること。
• スパーキルベースのイメージングにおける光学記憶効果によって通常制限されるスパーキルスキャン範囲を超えて、視野を拡大すること。
• 散乱媒体の事前特徴化や複雑な光学制御なしに、スパーキル相関が分解能を向上させられることを示すこと。
• 単なるコherent照明と散乱層を用いることで、従来の顕微鏡装置で200 nm未満の分解能を達成すること。

提案手法

• 561 nmのコherentビームをガリウムホスファイト（GaP）基板に照射し、表面に形成された2 µm厚の多孔質散乱層によってスパーキルパターンを生成する。
• 光学記憶効果の範囲内（Δθ ≈ 1°）で入射ビームを傾けることで、スパーキルパターンをサンプル上を移動させ、オブジェクト面のラスタースキャンを実現する。
• NA = 0.95の高数値NAの対物レンズを用い、蛍光発光を検出する。分解能はR = λ_flu/(2NA) = 322 nmであり、各ビーム傾きごとに全視野画像を取得する。
• スパーキルパターンの統計的相関を活用して、複数のスパーキルスキャン測定値を統合することで、広視野画像を再構成する平行スパーキル検出を実施する。
• 既知の点 spread 関数を用いて数値的デコンボリューションを適用し、真のオブジェクト分布を抽出して分解能を向上させる。
• 波面整形や透過行列測定を回避するため、ビーム傾き間でのスパーキルパターンの相関に依存して高分解能情報を抽出する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 散乱媒体内のスパーキル相関を活用することで、回折限界を超える広視野蛍光顕微鏡の分解能向上が可能か？
• RQ2 スパーキルベースのスーパーエンハンスドイメージングにおいて、分解能を損なわずに視野をどの程度拡大できるか？
• RQ3 散乱媒体の事前キャリブレーションや複雑な光学制御なしに、高分解能イメージングが達成可能か？
• RQ4 従来の顕微鏡対物レンズと単純な散乱レンズを用いた実用的実装で、達成可能な分解能は何か？

主な発見

• 10×10 µm²の視野において、復元分解能が130 nmに達し、従来の顕微鏡の分解能限界を著しく上回る。
• 中心間隔146 nmの2つの100-nm直径の蛍光ナノスフィアが、SCORE画像では明確に分離されているが、従来の顕微鏡では1つの解像不能なブロブとして表示される。
• 復元された点 spread 関数の半値全幅（FWHM）は140 nmであり、照射ビーム幅を考慮した理論限界値116 nmに近く、非常に高い性能を示す。
• 波面整形、透過行列測定、散乱媒体の事前特徴化なしに、分解能向上が達成された。
• サンプルのドリフトやレーザー指向ノイズに対して頑健であり、λ_ill = 550 nmのGaP（n = 3.45）を用いた場合、分解能限界は80 nmに近づく可能性がある。
• 理論的解析により、構造化照明顕微鏡と同様に、照射と検出の分解能限界を組み合わせることで、さらに分解能を64 nmまで向上できることが示された。