[論文レビュー] Growth and site-specific organization of micron-scale biomolecular devices on living mammalian cells

Sisi Jia, Siew Cheng Phua+8 more|arXiv (Cornell University)|Jan 19, 2021

Advanced biosensing and bioanalysis techniques参考文献 69被引用数 16

ひとこと要約

本研究では、受容体標的化DNAオリガミー種を用いて、生きた哺乳類細胞の特定部位にアタッチされ、動的成長を示すDNAナノチューブフィラメントの作製を実証した。アタッチされたナノチューブは、0–2 dyn/cm²のせん断応力センサーとして機能し、イン・サイトで成長することで、機械的力のリアルタイムモニタリングと、細胞構造へのキネティクス制御による統合を可能にする。

ABSTRACT

Mesoscale molecular assemblies on the cell surface, such as cilia and filopodia, integrate information, control transport and amplify signals. Synthetic devices mimicking these structures could sensitively monitor these cellular functions and direct new ones. The challenges in creating such devices, however are that they must be integrated with cells in a precise kinetically controlled process and a device's structure and its precisely structured cell interface must then be maintained during active cellular function. Here we report the ability to integrate synthetic micro-scale filaments, DNA nanotubes, into a cell's architecture by anchoring them by their ends to specific receptors on the surfaces of mammalian cells. These filaments can act as shear stress meters: how anchored nanotubes bend at the cell surface quantitatively indicates the magnitude of shear stresses between 0-2 dyn per cm2, a regime important for cell signaling. Nanotubes can also grow while anchored to cells, thus acting as dynamic components of cells. This approach to cell surface engineering, in which synthetic biomolecular assemblies are organized within existing cellular architecture, could make it possible to build new types of sensors, machines and scaffolds that can interface with, control and measure properties of cells.

研究の動機と目的

• 生きた哺乳類細胞表面への合成ミクロスケールバイオ分子デバイスの部位特異的でキネティクス制御可能な統合手法の開発を目的とする。
• 非特異的結合を最小限に抑え、標的への高効率付着を達成するという、細胞への大規模DNAナノチューブのアンカリングにおける課題を克服することを目的とする。
• モノマー供給を制御することで、アタッチされたナノチューブの動的再編成を可能にする、アンカーリングナノチューブの成長を可能とすることを目的とする。
• 細胞にアンカーリングされたナノチューブが、生理的に妥当な範囲（0–2 dyn/cm²）で定量的せん断応力センサーとして機能することを実証することを目的とする。

提案手法

• 特定の細胞表面受容体（例：EGFR）を標的とするために、機能化された端を持つDNAオリガミー基盤ナノチューブ種を用いた。
• ナノチューブモノマーおよび種のPEG化を実施し、細胞膜との非特異的相互作用を低減した。
• EGFR特異的AMD（抗体模倣ドメイン）を用いて、ヘラ細胞への高親和性・部位特異的アタッチメントを実現した。
• マイクロフルイディクス・チャンバーを用いて制御された層流を印加し、定義されたせん断応力（0–2 dyn/cm²）を発生させ、時間分解能を有する共焦点顕微鏡を用いてナノチューブの曲げを測定した。
• アタッチされた種に活性化モノマーを供給することで、イン・サイトでのナノチューブ成長を開始し、蛍光イメージングおよび時間分解能追跡によってモニタリングした。
• 最大強度投影法と、時間経過に伴う種およびフィラメント数の手動追跡を用いて、ナノチューブのダイナミクスを定量した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 生きた哺乳類細胞の特定受容体に、非特異的結合を最小限に抑えて安定してアタッチ可能なDNAナノチューブは実現可能か？
• RQ2 アタッチされたDNAナノチューブは、モノマー供給に応じて動的成長を示しつつ、細胞表面への付着を維持できるか？
• RQ3 細胞にアタッチされたナノチューブの曲げは、生理的に妥当な範囲（0–2 dyn/cm²）のせん断応力を定量的に報告できるか？
• RQ4 本システムは、異なる細胞表面受容体を標的にできるか？また、細胞の能動的プロセス中でも機能的統合を維持できるか？

主な発見

• 64 pMの濃度で、ヘラ細胞あたり平均107±17個のDNAナノチューブ種が付着した。PEGコーティングにより非特異的結合は検出されなかった。
• PEGコーティングされたナノチューブ（モノマーおよび種）は、細胞に付着しなかった。非特異的相互作用の効果的抑制が確認された。
• EGFRを介したアタッチメントにより、液体中での流れの下でナノチューブに測定可能な曲げが観察された。全回転角は、せん断応力（0–2 dyn/cm²）と相関した。
• アタッチされた種からイン・サイトでのナノチューブ成長が観察された。4時間後の結合イベントの割合は0.6%であった。
• 細胞表面におけるナノチューブの動的再編成が可能となり、フィラメントは3 µmを超える長さに成長し、構造的安定性を維持した。
• せん断応力センシングは定量的であった。ナノチューブの曲げ角度は、印加せん断応力に比例して増加し、機械的センサーとしての機能が裏付けられた。