[論文レビュー] High-resolution transport-of-intensity quantitative phase microscopy with annular illumination

Chao Zuo, Jiasong Sun+4 more|arXiv (Cornell University)|Apr 13, 2017

Digital Holography and Microscopy参考文献 92被引用数 13

ひとこと要約

本論文は、従来のTIEイメージングにおける分解能とコントラストの限界を克服するため、環状照明を用いたトランスポート・オブ・インテンシティ定量的位相顕微鏡（AI-TIE）を提案する。円形照明を対応する対物レンズのNAに合わせた環状照明に置き換えることで、低空間周波数成分の位相コントラストが向上し、横方向分解能208 nm（有効NA 2.66に相当）を達成する。これにより、最小限の光傷害で高精度で非侵襲的なライブセルイメージングが可能となり、標準的な明-field顕微鏡と互換性がある。

ABSTRACT

For quantitative phase imaging (QPI) based on transport-of-intensity equation (TIE), partially coherent illumination provides speckle-free imaging, compatibility with brightfield microscopy, and transverse resolution beyond coherent diffraction limit. Unfortunately, in a conventional microscope with circular illumination aperture, partial coherence tends to diminish the phase contrast, exacerbating the inherent noise-to-resolution tradeoff in TIE imaging, resulting in strong low-frequency artifacts and compromised imaging resolution. Here, we demonstrate how these issues can be effectively addressed by replacing the conventional circular illumination aperture with an annular one. The matched annular illumination not only strongly boosts the phase contrast for low spatial frequencies, but significantly improves the practical imaging resolution to near the incoherent diffraction limit. By incorporating high-numerical aperture (NA) illumination as well as high-NA objective, it is shown, for the first time, that TIE phase imaging can achieve a transverse resolution up to 208 nm, corresponding to an effective NA of 2.66. Time-lapse imaging of in vitro Hela cells revealing cellular morphology and subcellular dynamics during cells mitosis and apoptosis is exemplified. Given its capability for high-resolution QPI as well as the compatibility with widely available brightfield microscopy hardware, the proposed approach is expected to be adopted by the wider biology and medicine community.

研究の動機と目的

• 円形照明を用いた部分的コherentなトランスポート・オブ・インテンシティ定量的位相イメージング（TIE-QPI）における、内在的なノイズ対分解能トレードオフと低位相コントラストを解決すること。
• 複雑な光学系や時間的コherenecyを要しないで、TIE-QPIの横方向分解能を非coherentな回折限界に近づけること。
• 特に有丝分裂やアポトーシスのような動的プロセスの観察を可能にする、高精度で低ノイズ、光傷害のないライブセルのタイムラプスイメージングを実現すること。
• ハロゲンランプやKöhler照明を含む、従来の明-field顕微鏡のハードウェアと互換性を持つことを示すことにより、生物学的・医学的分野における広範な応用を可能とすること。

提案手法

• 対物レンズの数値孔径（NA）に一致するように、標準的な円形照明アパーチャーを環状アパーチャーに置き換えることで、照明関数を整形し、システムの応答を最適化する。
• 高NAのオイルインマージョンレンズと環状照明を組み合わせ、有効NA 2.66を達成し、非coherentな回折限界に近づける。
• 複数の軸方向のデフォーカス位置における強度測定から、トランスポート・オブ・インテンシティ方程式（TIE）を用いて定量的位相を再構築する。
• 部分的コherentな伝達関数（WOTF）を用いてシステム応答をモデル化し、環状照明が低・高空間周波数成分の両方の位相コントラストを向上させる周波数カバレッジを最適化する。
• 高NAの照明と検出を組み合わせることで分解能を向上させ、スプライクルノイズを抑制し、スプライクルフリーで安定した位相再構築を実現する。
• 50 ms露光時間、1フレーム/秒のタイムラプスイメージングを用いて、動的細胞プロセスを捉える。定量的位相マップから位相コントラスト画像およびDIC画像を生成する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 環状照明は、従来の円形照明と比較して、TIEベースの定量的位相イメージングにおける位相コントラストと分解能を顕著に向上させるか？
• RQ2 適切に調整された光源分布を有する部分的コherentな照明を用いた場合、TIE-QPIはどの程度非coherentな回折限界に近づけるか？
• RQ3 高NA環状照明の使用は、ライブセル位相イメージングにおけるノイズ性能と画像忠実度にどのように影響を与えるか？
• RQ4 AI-TIEは、特殊なレーザーや複雑な干渉計測定装置を必要とせず、標準的な明-field顕微鏡に実装可能か？
• RQ5 この手法は、有糸分裂やアポトーシスのような細胞小器官の動的変化を、高空間分解能と低光傷害で解像可能か？

主な発見

• AI-TIEは横方向分解能208 nmを達成し、有効数値孔径2.66に相当する。これは、TIEベースの定量的位相イメージング分野で報告された最高の分解能である。
• 低空間周波数成分の位相コントラストが顕著に向上し、従来のTIEイメージングで一般的に見られる低周波数アーティファクトが低減された。
• ノイズが最小限に抑えられ、非細胞領域における360回の独立測定で標準偏差がわずか1.81 pgにとどまる。これは、高い安定性と低ノイズ性を示している。
• in vitroのヘラ細胞のタイムラプスイメージングにより、核凝縮、細胞質の凝集、膜のびらん、アポトーシス体形成といった明確な形態的変化が観察された。
• ハロゲンランプやKöhler照明を含む従来の明-field顕微鏡ハードウェアと互換性があるため、生物学的・医学的研究室での広範な導入が可能である。
• 現在のところ、機械的zスキャンによる制限で1フレーム/秒の速度に留まっているが、空間光変調器や電気的に可変なレンズを用いることで、動画レートへの高速化が可能である。