[論文レビュー] High Speed Two-Photon Lifetime Imaging

Sebastian Karpf, Bahram Jalali|arXiv (Cornell University)|Sep 2, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques被引用数 2

ひとこと要約

本稿では、波長スイープレーザーと角分散を用いた慣性なしのビームスティーリングにより、8800万ピクセル/秒の高速取得を実現する高精度な2光子寿命イメージングシステムを提案する。このシステムは、1ピクセルあたりの単一光子感度を備えたキロヘルツフレームレートを達成し、リアルタイムで回折限界の分解能を有する蛍光およびFLIMイメージングを可能にし、画像支援細胞ソーティングなどの高スループット応用に適している。

ABSTRACT

Two-Photon Microscopy has become an invaluable tool for biological and medical research, providing high sensitivity, molecular specificity, inherent three-dimensional sub-cellular resolution and deep tissue penetration. In terms of imaging speeds, however, mechanical scanners still limit the acquisition rates to typically 10-100 frames per second. Here we present a high-speed non-linear microscope achieving kilohertz frame rates by employing pulse-modulated, rapidly wavelength-swept lasers and inertia-free beam steering through angular dispersion. In combination with a high bandwidth, single-photon sensitive detector, we achieve recording of fluorescent lifetimes at unprecedented speeds of 88 million pixels per second. We show diffraction-limited, multi-modal, Two-Photon fluorescence and fluorescence lifetime (FLIM), microscopy and imaging flow cytometry with a digitally reconfigurable laser, imaging system and data acquisition system. These unprecedented speeds should enable high-speed and high-throughput image-assisted cell sorting.

研究の動機と目的

• 従来の2光子顕微鏡が機械的スキャナによって1秒間に10～100フレームに制限される速度の限界を克服すること。
• 動的生物学的プロセスおよび高スループット応用に適した、高速で帯域幅の広い蛍光寿命イメージング（FLIM）を実現すること。
• 迅速なビームスティーリングと高帯域幅検出を備えたデジタル再構成可能なイメージングシステムを開発し、前例のない高速取得を達成すること。
• 慣性なしのビームスティーリングを実現するため、パルス変調された急速な波長スイープレーザーと角分散を統合することにより、機械的スキャンの遅延を排除すること。
• キロヘルツフレームレートを達成する単一光子感度を備えたシステムにより、生きた細胞および組織における高感度・高分解能の寿命イメージングを可能にすること。

提案手法

• 高い繰り返しレートと可変な中心波長を持つ励起パルスを生成するために、パルス変調された急速な波長スイープレーザーを採用する。
• 機械的部品を用いない角分散を用いてビームをスティーリングし、慣性なしの高速ビームスキャンを実現する。
• 高い帯域幅と単一光子感度を持つ検出器を実装し、高時間分解能で蛍光減衰信号を捕捉する。
• スイープレーザー光源とデジタル再構成可能なイメージングシステムを組み合わせ、リアルタイムでマルチモードの2光子蛍光およびFLIMイメージングを可能にする。
• 8800万ピクセル/秒という高スループットのピクセルレートを処理できるデータ取得システムを活用し、リアルタイムの寿命解析を支援する。
• システムの再構成可能性を活かして、静的イメージングとイメージングフローサイトメトリーの両方の応用に対応できる。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 波長スイープレーザーと角分散を用いることで、機械的スキャンを排除した2光子顕微鏡でキロヘルツフレームレートを達成できるか？
• RQ2 2光子FLIMにおいて、高帯域幅で単一光子感度を持つ検出器が達成可能な最大ピクセル取得レートは何か？
• RQ3 超高速動作下でも回折限界の分解能と分子特異性を維持できるか？
• RQ4 デジタル再構成可能なレーザーとデータ取得システムの統合により、画像支援細胞ソーティングなどの高スループットイメージング応用が可能になるか？
• RQ5 100フレーム/秒を超えるフレームレートでも、蛍光寿命測定において高感度と高時間分解能を維持できるか？

主な発見

• 本システムは、記録的な1秒あたり8800万ピクセルの取得速度を達成し、リアルタイムで高スループットな2光子イメージングを可能にした。
• 角分散を用いた慣性なしのビームスティーリングと急速な波長スイープレーザーにより、機械的スキャンの制限を排除し、キロヘルツフレームレートを実現した。
• 高感度と高分解能を備えた回折限界のマルチモード2光子蛍光および蛍光寿命イメージング（FLIM）をサポートした。
• 高帯域幅の単一光子検出により、超高速フレームレート下でも正確な寿命測定が可能になった。
• デジタル再構成可能なレーザーとイメージングシステムにより、静的イメージングとイメージングフローサイトメトリーの両方のモードで柔軟に運用可能となった。
• 迅速な取得と分子特異性、および細胞内分解能を組み合わせることで、高速で画像支援の細胞ソーティングが実現可能となった。