[論文レビュー] In silico design, in vitro construction and in vivo application of synthetic small regulatory RNAs in bacteria

Martin Brueck, Bork A. Berghoff+1 more|arXiv (Cornell University)|Apr 28, 2023

Bacterial Genetics and Biotechnology参考文献 19被引用数 4

ひとこと要約

本論文では、SEEDlingを用いたin silico予測、ゴールデンゲート法を用いたin vitroアセンブリ、およびフェノタイプスクリーニングまたは蛍光レポーターを用いた機能的検証により、細菌における合成小サイズ規制RNA（sRNA）の設計・構築・検証を簡略化したパイプラインを提示する。このアプローチにより、*E. coli*におけるacrA mRNAの発現抑制に成功し、オキサシリン耐性の増加によってsRNA機能が確認された。

ABSTRACT

Small regulatory RNAs (sRNAs) are short non-coding RNAs in bacteria capable of post-transcriptional regulation. sRNAs have recently gained attention as tools in basic and applied sciences for example to fine-tune genetic circuits or biotechnological processes. Even though sRNAs often have a rather simple and modular structure, the design of functional synthetic sRNAs is not necessarily trivial. This protocol outlines how to use computational predictions and synthetic biology approaches to design, construct and validate synthetic sRNA functionality for their application in bacteria. The computational tool, SEEDling, matches the optimal seed region with the user-selected sRNA scaffold for repression of target mRNAs. The synthetic sRNAs are assembled using Golden Gate cloning and their functionality is subsequently validated. The protocol uses the acrA mRNA as an exemplary proof-of-concept target in Escherichia coli. Since AcrA is part of a multidrug efflux pump, acrA repression can be revealed by assessing oxacillin susceptibility in a phenotypic screen. However, in case target repression does not result in a screenable phenotype, an alternative validation of synthetic sRNA functionality based on a fluorescence reporter is described.

研究の動機と目的

• 細菌における機能的合成sRNAを設計するための信頼性が高くモジュラーなパイプラインの開発。
• 単純なモジュラー構造にもかかわらず、sRNA設計が非自明であるという課題に対処。
• 合成生物学およびバイオテクノロジー分野における精密な翻訳後遺伝子調節を可能にする。
• フェノタイプスクリーニングと蛍光レポーターを代替検証法として用いた検証済みワークフローの提供。

提案手法

• ユーザーが選択したsRNAスケルトンと標的mRNAの抑制に適した最適なシード領域を特定するために、SEEDling計算ツールを活用する。
• in silico予測を用いて、特定のmRNAを標的にする定義済みのシード配列を有する合成sRNAコンストラクトを設計する。
• 高精度でモジュラーかつ効率的なin vitro構築を実現するため、ゴールデンゲート法を用いて合成sRNAをアセンブルする。
• *Escherichia coli*に導入し、in vivo発現および機能的テストを実施する。
• acrAの発現抑制が多剤放出ポンプを破壊するため、オキサシリン耐性を用いたフェノタイプスクリーニングによりsRNA機能を検証する。
• 顕著なフェノタイプが得られない場合の代替検証法として、蛍光レポーター系を用いる。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 SEEDlingのような計算予測ツールは、特定のmRNAを標的にする合成sRNAの機能的シード領域を信頼性を持って同定できるか？
• RQ2 ゴールデンゲート法は、高精度でモジュラーな合成sRNAの構築に有効な手法であるか？
• RQ3 オキサシリン耐性を用いたフェノタイプスクリーニングにより、合成sRNAによるacrA mRNAの発現抑制を検出できるか？
• RQ4 顕著なフェノタイプ出力が得られない場合、sRNA機能はどのように検証できるか？
• RQ5 蛍光レポーター系は、フェノタイプスクリーニングの代替としてsRNA検証に信頼性をもって用いられるか？

主な発見

• SEEDlingツールは、*E. coli*におけるacrA mRNA標的の効果的抑制を可能にする機能的シード領域を的確に同定した。
• ゴールデンゲート法により、高モジュラリティと高正確性を備えた合成sRNA遺伝子の効率的かつ正確なin vitro構築が実現された。
• acrA mRNAの発現抑制によりオキサシリン耐性が上昇し、フェノタイプスクリーニングによる機能的sRNA活性の確認がなされた。
• フェノタイプ出力が得られない場合、蛍光レポーター系がsRNA機能の検証に信頼性をもって代替可能であった。
• acrAをプローブターゲットとして用いることで、in silico設計からin vivo検証までの全パイプラインが成功裏に実証された。