[論文レビュー] Kinesin Motor Transport is Altered by Macromolecular Crowding and Transiently Associated Microtubule-Associated Proteins

Leslie Conway, Jennifer L. Ross|arXiv (Cornell University)|Sep 11, 2014

Microtubule and mitosis dynamics参考文献 16被引用数 5

ひとこと要約

本研究は、再構成系を用いて不活性なコントラクターと動的かつ一時的に結合する微小小管関連タンパク質（MAPs）が、in vitro 条件下における単一キネシン-1モーター輸送に与える影響を調査する。コントラクターと動的MAPsを用いた実験から、コントラクターはキネシンの走行長を延長するが、脱水力による非特異的拡散を増加させるのに対し、一時的結合するMAPsは前進運動を遅くするが、モーターの結合時間に影響を与えないことが判明。これは、トウのような安定的に結合するMAPsとは対照的である。

ABSTRACT

Intracellular transport of vesicular cargos, organelles, and other macromolecules is an essential process to move large items through a crowded, and inhomogeneous cellular environment. In an effort to dissect the fundamental effects of crowding and an increasingly complex cellular environment on the transport of individual motor proteins, we have performed in vitro reconstitution experiments with single kinesin-1 motors walking on microtubules in the presence of crowding agents and transient microtubule-associated proteins that more closely emulate the cellular environment. Macromolecular crowding due to inert polymers caused enhanced run lengths of motors, but displayed an increased tendency for non-specific motor association and diffusion, most likely due to depletion interactions. We found that transiently bound associated proteins slowed forward motion, but did not drastically affect the association times, in opposition to previously reported obstacle properties of stably associated microtubule-associated proteins, such as the neuronal protein tau. Such studies of the transport properties of molecular motors in increasingly complex reconstituted environments are important to illuminate the fundamental biophysical principles underlying the essential process of intracellular cargo transport.

研究の動機と目的

• マクロ分子コントラクターが制御されたin vitro環境下でキネシン-1モーター輸送に与える影響を理解すること。
• 生理的複雑性を模倣する一時的に結合する微小小管関連タンパク質（MAPs）がキネシンモビリティに与える影響を調査すること。
• 既知の障害物として機能する安定的に結合するMAPs（例：トウ）と比較して、一時的結合するMAPsの影響を検討すること。
• 凝集的かつ不均一な条件下における細胞内キャリア輸送を支配する根本的な物性的原則を解明すること。

提案手法

• 精製されたキネシン-1モーターと安定化された微小小管を用いたin vitro再構成実験を実施した。
• 細胞内環境の密度を模倣するために不活性なコントラクター（例：フィコール、デキストラン）を導入した。
• 微小小管上での動的タンパク質相互作用を模倣するために一時的に結合するMAPsを追加した。
• リアルタイムで単一キネシン-1モーターを可視化・追跡するために全内部全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いた。
• さまざまなコントラクターおよびMAP条件下でのモーター走行長、速度、結合／解離時間の定量的評価を実施した。
• 統計的手法を用いてコントラクターおよび一時的MAPsのモーター輸送パラメータへの影響を分析した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 マクロ分子コントラクターはキネシン-1の走行長およびモビリティダイナミクスにどのように影響を与えるか？
• RQ2 一時的に結合するMAPsはキネシン-1の前進速度およびプロセッシビティにどのような影響を与えるか？
• RQ3 一時的結合するMAPsは、障害物として知られる安定的に結合するMAPs（例：トウ）と比較して、キネシン輸送にどのように影響を与えるか？
• RQ4 凝集的条件下でのキネシン行動の変化を引き起こす物理的メカニズムは何か？

主な発見

• 不活性ポリマーを用いたマクロ分子コントラクターにより、キネシン-1の走行長が延長され、凝集的条件下でのプロセッシビティの向上が示された。
• コントラクターは、モーターと微小小管間の脱水力による相互作用によって、非特異的モーター凝集および拡散を誘発した可能性がある。
• 一時的に結合するMAPsは、モーターの結合時間に変化をもたらさないまま、キネシン-1の前進運動を顕著に遅くした。
• 一時的MAPsのキネシンモビリティへの影響は、トウのような安定的に結合するMAPsとは明確に異なり、これらは強力な障害物として知られている。
• 結果から、動的かつ一時的なMAPsとの相互作用が、モーター移動を恒久的に妨げることなく輸送調節に寄与することが示唆された。
• コントラクター由来の脱水力が、モーター集積および非特異的拡散を促進する主要なメカニズムであると同定された。