[論文レビュー] Learning an optimal PSF-pair for ultra-dense 3D localization microscopy

Elias Nehme, Boris Ferdman+5 more|arXiv (Cornell University)|Sep 29, 2020

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 104被引用数 5

ひとこと要約

本論文は、エンド・ツー・エンドの微分可能学習を用いて、超高密度3次元単分子局在化顕微鏡を可能にする二重ポイントスプレッド関数（PSF）イメージングシステムを提案する。2つの補完的PSF—具体的にはNebulae PSFペア—を設計することで、3次元における検出精度と局在化精度が著しく向上し、蛍光標識されたテロメアを用いたシミュレーションおよび生細胞実験において、従来の単一PSFおよび二重PSF手法を上回る性能を発揮した。

ABSTRACT

A long-standing challenge in multiple-particle-tracking is the accurate and precise 3D localization of individual particles at close proximity. One established approach for snapshot 3D imaging is point-spread-function (PSF) engineering, in which the PSF is modified to encode the axial information. However, engineered PSFs are challenging to localize at high densities due to lateral PSF overlaps. Here we suggest using multiple PSFs simultaneously to help overcome this challenge, and investigate the problem of engineering multiple PSFs for dense 3D localization. We implement our approach using a bifurcated optical system that modifies two separate PSFs, and design the PSFs using three different approaches including end-to-end learning. We demonstrate our approach experimentally by volumetric imaging of fluorescently labelled telomeres in cells.

研究の動機と目的

• 高密度3次元局在化顕微鏡において、横方向のPSF重なりが性能を低下させるという単一PSF設計の限界を克服すること。
• 2つの異なるPSFを共同最適化することで、超高密度サンプルにおける検出および局在化精度を向上させるマルチPSFシステムの開発。
• エンド・ツー・エンド微分可能イメージングとディープラーニングを活用し、光学系（位相マスク）と局在化アルゴリズムを同時に最適化すること。
• 固定および生きたU2OS細胞におけるテロメアの3次元イメージングを用いて、実験的検証を行い、高密度領域における性能向上を示すこと。

提案手法

• 液体結晶空間光変調器（LC-SLM）を共役背後焦点面に配置し、2つの独立した光学経路を持つ分岐光学系を設計し、異なる位相マスクを適用する。
• 3つのPSFペア設計戦略を採用：(1) クラメール・ラオ低限界（CRLB）に基づく最適化、(2) Tetrapod-EDOFペア、(3) 深層ニューラルネットワークを用いたエンド・ツー・エンド微分可能学習。
• 微分可能イメージングモデルを用いて、局在化誤差勾配を光学系を逆方向に伝搬させ、位相マスクと局在化ネットワークの共同最適化を可能にする。
• 2チャネル画像からの3次元位置推定を目的とした深層ニューラルネットワークを訓練し、損失関数にはジャカード係数と横方向および軸方向の平均二乗誤差（RMSE）を用いる。
• 1発光体あたり15,000光子の信号と1ピクセルあたり500光子のバックグラウンドを想定したシミュレーテッドデータを用いてPSFペアを検証し、固定および生細胞サンプルでも結果を確認した。
• 最適化されたNebulae PSFペアを用いて、U2OS細胞における蛍光標識テロメアの3次元スーパーレゾリューションイメージングを実施し、高い再構成忠実度を達成した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 二重PSFシステムは、単一PSF手法と比較して、超高密度3次元単分子局在化顕微鏡における検出および局在化性能を顕著に向上させることができるか？
• RQ2 光学系と局在化アルゴリズムの両方をエンド・ツー・エンド微分可能最適化することで、高密度3次元イメージングに最適なPSFペアが得られるか？
• RQ3 CRLBに基づく、Tetrapod-EDOF、およびエンド・ツー・エンド学習されたPSFペアの3種類の設計方法は、現実的なノイズおよび密度条件下で、検出精度と局在化精度の観点からどのように比較されるか？
• RQ4 学習されたNebulae PSFペアは、発光体密度と信号対雑音比が厳しい生細胞イメージングにおいても高い性能を維持できるか？

主な発見

• 固定細胞実験では、Nebulae PSFペアが85.29%という最高のジャカード係数を達成し、Tetrapod-EDOFペア（67.65%）およびCRLBペア（74.53%）を顕著に上回った。
• 142個の発光体を含む大きな細胞では、Nebulae PSFペアがジャカード係数91.84%を維持したのに対し、Tetrapod-EDOFペアは87.67%、CRLBペアは91.03%であった。
• エンド・ツー・エンドに学習されたNebulae PSFペアは、高密度下での軸方向RMSEにおいて、単一チャネルでエンド・ツー・エンド最適化されたPSFでさえも上回る、最高の軸方向局在化精度を達成した。
• Tetrapod-EDOFペアにおける誤って検出されない発光体（フェイル・ネガティブ）の主な原因は、低信号効率に起因しており、発光体がノイズの閾値近くに位置する場合に検出されなかった。これは、より信号効率の高いNebulae PSFsによって是正された。
• シミュレーションにより、Nebulae PSFペアが、すべてのテストされた発光体密度において、検出（ジャカード係数）および局在化精度（横方向および軸方向RMSE）の両面で、他のすべての代替手法を上回ることが確認された。
• 二重チャネルシステムにより、生細胞におけるテロメアの堅牢な3次元スーパーレゾリューションイメージングが可能となり、動的生物学的研究への実用的妥当性が示された。