[論文レビュー] Loss of Cell-Substrate Adhesion Leads to Periodic Shape Oscillations in Fibroblasts

Pramod A. Pullarkat|ArXiv.org|Dec 15, 2006

Cellular Mechanics and Interactions被引用数 7

ひとこと要約

本研究では、3T3線維芽細胞が基底から剥離された状態で、アクチノミオシン収縮性とカルシウムシグナリングによって駆動される、持続的で周期的な形状の振動を示すことを示した。これらの振動は一定周波数で数時間にわたって持続し、MLCKおよびラオキシナーゼ経路によって調節されており、伸張活性化チャネルを通じた細胞外カルシウムの流入がダイナミクスに不可欠であることが判明した。これは、コートラクトアクチノミオシンゲルの根本的な機械的応答を示している。

ABSTRACT

We report the phenomenon of periodic shape oscillations occurring in 3T3 fibroblasts merely as a consequence of a loss of cell-substrate adhesion. The oscillatory behavior can last many hours at a constant frequency, and can be switched off and on using chemical agents. This robustness allows for the extraction of quantitative data using single cells. We demonstrate that the frequency of oscillations increases with increasing actomyosin contractility. Both the Myosin Light Chain Kinase as well as the Rho Kinase pathways are shown to operate during this process. Further, we reveal significant similarities between the oscillatory dynamics and the commonly observed phenomenon of blebbing. We show that both these processes ceases when extracellular calcium is depleted or when stretch activated calcium channels are blocked. This, along with the fact that these dynamical processes require actomyosin contactility points towards strong similarities in the respective mechanisms. Finally, we speculate on a possible mechanism for the observed dynamical phenomena.

研究の動機と目的

• 細胞-基底接着の喪失が単独で線維芽細胞に持続的形状振動を誘発できるかどうかを調査すること。
• アクチノミオシン収縮性とカルシウムシグナリングが、これらの振動を維持するために果たす役割を特定すること。
• 形状振動のダイナミクスをブリーブィングや他の細胞骨格行動と比較すること。
• 薬理学的薬剤を用いない状態での周期的形状変化のバイオフィジカルメカニズムを明らかにすること。
• 生きた細胞におけるアクティブ収縮性ゲルを研究するための単純で強固なモデル系を確立すること。

提案手法

• 細胞はトリプシン処理または穏やかな振とうによって培養フラスコから剥離され、ガラス底プレートに移して浮遊状態を維持した。
• 温度制御（±0.1 °C）を施した位相差顕微鏡を用いて、リアルタイムで形状ダイナミクスを観察した。
• 画像解析により重心位置または囲まれた面積を追跡し、振動周波数と振幅を定量した。
• MLCKおよびラオキシナーゼ阻害薬を用いて、これらの酵素が振動調節に果たす役割を評価した。
• 細胞外カルシウムの枯渇と伸張活性化カルシウムチャネル遮断薬を用いて、カルシウム依存性を検証した。
• 選択的実験において、EM-CCDを用いた蛍光画像法で細胞骨格ダイナミクスをモニタリングした。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 線維芽細胞は、薬理学的介入や基底接着なしに周期的な形状振動を示せるか？
• RQ2 アクチノミオシン収縮性は、これらの振動の周波数をどのように決定しているか？
• RQ3 細胞外カルシウムは、振動の開始および維持に必要とされるか？
• RQ4 形状振動のメカニズムは、ブリーブィングのそれとどのように比較できるか？
• RQ5 観察された規則的な周期的振動行動を特徴づけるアクチノミオシンゲルのバイオフィジカル的性質は何か？

主な発見

• 浮遊状態の線維芽細胞は、薬剤投与なしに数時間にわたって持続的で周期的な形状振動を示し、周波数は一定である。
• 振動周波数はアクチノミオシン収縮性が高くなると上昇し、MLCKおよびラオキシナーゼ経路の両方がミオシン活性化に寄与している。
• 細胞外カルシウムの枯渇または伸張活性化カルシウムチャネルの遮断により振動が消失することから、カルシウム流入が極めて重要であることが示された。
• 形状振動のダイナミクスは、特にカルシウム依存性および収縮メカニズムにおいて、ブリーブィングと強く類似している。
• この振動行動は強固で再現可能であり、単一細胞におけるアクティブ収縮性ゲルを研究するための実用的モデル系である。
• これらの結果から、この周期的応答は線維芽細胞におけるコートラクトアクチノミオシンゲルの根本的な機械的性質であると示唆される。