[論文レビュー] Methods to calibrate and scale axial distances in confocal microscopy as a function of refractive index

Thijs H. Besseling, Jissy Jose+1 more|arXiv (Cornell University)|Apr 15, 2014

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 1被引用数 10

ひとこと要約

本稿では、屈折率（RI）の不一致とベクトル光効果を考慮することで、3次元共焦点顕微鏡における軸方向距離を実用的かつ正確にキャリブレーションする2つの手法を提示する。ガラスセルを用いたファブリ・ペロー干渉に基づく高さ測定と、大型の蛍光被膜付マイクロスフィアを用いて、軸方向スケーリング係数がRIに線形的に依存しており、幾何光学の予測とは対照的に、完全なベクトル光理論とよく一致することを実証した。一方、ミクロンサイズの球体は、RI不一致がなくてもPSF効果により顕著に引き伸ばされており、軸方向キャリブレーションに不適切であることが示された。

ABSTRACT

Accurate distance measurement in 3D confocal microscopy is important for quantitative analysis, volume visualization and image restoration. However, axial distances can be distorted by both the point spread function and by a refractive-index mismatch between the sample and immersion liquid, which are difficult to separate. Additionally, accurate calibration of the axial distances in confocal microscopy remains cumbersome, although several high-end methods exist. In this paper we present two methods to calibrate axial distances in 3D confocal microscopy that are both accurate and easily implemented. With these methods, we measured axial scaling factors as a function of refractive-index mismatch for high-aperture confocal microscopy imaging. We found that our scaling factors are almost completely linearly dependent on refractive index and that they were in good agreement with theoretical predictions that take the full vectorial properties of light into account. There was however a strong deviation with the theoretical predictions using (high-angle) geometrical optics, which predict much lower scaling factors. As an illustration, we measured the point-spread-function of a point-scanning confocal microscope and showed that an index-matched, micron-sized spherical object is still significantly elongated due to this PSF, which confirms that single micron-sized spheres are not well suited to determine accurate axial calibration nor axial scaling.

研究の動機と目的

• サンプルと浸漬媒体間の屈折率（RI）不一致と点スプレッド関数（PSF）歪みが原因で生じる共焦点顕微鏡における軸方向距離測定の不正確さという課題に対処する。
• しばしば面倒または不正確であるため、既存の軸方向キャリブレーション手法の限界を克服する。
• 高数値孔径共焦点顕微鏡における日常的使用に適した、実験的に検証された実用的キャリブレーション手法を提供する。
• 実験的軸方向スケーリング係数と、幾何光学とベクトル光理論に基づく理論的予測との乖離を明確にする。
• ミクロンサイズの球状粒子が、RI不一致がなくてもPSFに起因する軸方向の引き伸ばしにより、軸方向キャリブレーションに不適切であることを示す。

提案手法

• 独自に設計したガラスカバーガラスベースのキャリブレーションセルを構築し、透過スペクトルにおけるファブリ・ペロー干渉縞を用いて、1μm未満の精度でその正確な高さを測定する。
• 蛍光染料をドーピングした4種類のRIマッチド溶媒をセルに充填し、屈折率（1.3–1.5）の範囲で軸方向距離を像として得る。
• 干渉縞からの測定された軸方向スケーリング係数を用いて、油浸しレンズ（NA = 1.4）におけるRI関数としての軸方向距離歪みを特定する。
• 大粒径（約50 µm）の蛍光被膜付マイクロスフィアを第二のキャリブレーション手法として用い、内部散乱を最小限に抑える薄い蛍光被膜を活用して正確な軸方向測定を可能にする。
• 軸方向キャリブレーションの前段階として、標準キャリブレーショングリッドを用いて横方向キャリブレーションを実施し、正確な横方向分解能を確保する。
• 実験的軸方向スケーリング係数を、ベクトル光の理論的予測（Sheppard & Török, 1997）と幾何光学の理論的予測（Visser et al., 1992）と比較し、各モデルの妥当性を評価する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 高数値孔径共焦点顕微鏡における軸方向スケーリング係数は、試料と浸漬媒体間の屈折率不一致にどのように依存するか？
• RQ2 実験的軸方向キャリブレーション結果は、ベクトル光伝搬に基づく理論モデルと幾何光学に基づく理論モデルのどちらにより一致するか？
• RQ3 ミクロンサイズの球状粒子は、RI不一致がなくても信頼性高く軸方向距離キャリブレーションに使用可能か、それともPSFに起因する形状歪みがあるか？
• RQ4 共焦点顕微鏡における軸方向距離をキャリブレーションするための、実用的で正確かつ容易に実装可能な手法は何か？
• RQ5 軸方向PSFは、サブミクロン粒子の外見的形状にどのように影響を及ぼすか？ 3次元イメージングとキャリブレーションにどのような意味を持つのか？

主な発見

• 共焦点顕微鏡における軸方向スケーリング係数は、屈折率（RI）が1.3–1.5の範囲でほぼ線形的に依存しており、この範囲での経験的キャリブレーションが可能である。
• 実験的軸方向スケーリング係数は、完全な電磁界特性を考慮するベクトル光理論（例：Sheppard & Török, 1997）とよく一致するが、幾何光学に基づく予測とは著しく乖離している。
• 幾何光学モデルは、実際の測定値と比べて軸方向スケーリング係数を著しく低く予測しており、最大で観測値の1/3程度まで低下するため、高NA系には適用不可能であることが示された。
• RI不一致がなくても、1 µmの蛍光球は、顕微鏡の固有のPSFに起因して顕著に軸方向に引き伸ばされており、このような粒子は軸方向キャリブレーションに不適切であることを示した。
• ガラスセル内でのファブリ・ペロー干渉法により、非常に正確に直接的に軸方向距離を測定でき、異なるRIにおける正確なキャリブレーションが可能である。
• 大粒径（約50 µm）の蛍光被膜付マイクロスフィアは、薄い蛍光被膜により内部散乱が最小限に抑えられ、正確な軸方向距離測定が可能であるため、効果的なキャリブレーション粒子である。