[論文レビュー] Molecular techniques to characterize the invA genes of Salmonella spp. for pathogen inactivation study in composting

Norshuhaila Mohamed Sunar, E.I. Stentiford+2 more|arXiv (Cornell University)|Apr 21, 2014

Salmonella and Campylobacter epidemiology参考文献 18被引用数 7

ひとこと要約

本研究では、低濃度またはVBNC状態にあっても正確な検出が可能な、PCRを用いたinvA遺伝子標的法を用いて堆肥化過程におけるサルモネラ属インoculantの分子的特徴を解析した。特異的プライマーを用い、約285 bpの増幅産物を得ることで、堆肥化前におけるサルモネラの存在を確認した。8日後には、英国PAS 100基準を下回る病原性レベルに低下しており、ラボスケール反応器において効果的な不活化が確認された。

ABSTRACT

The relatively low concentration of pathogen indicators, such Salmonella, in composting sometimes causes a problem with detection when using the conventional techniques. The presence of viable but non-culturable (VBNC) organisms is also a potential problem with Salmonella detection when using conventional techniques. In this study, the molecular approach for organism recognition, known as Polymerase Chain Reaction (PCR), was used for characterisation the Salmonella spp. used as inoculums in composting. This study also provides a better understand about selecting the suitable primer for Salmonella spp. The specificity of the probes and primers at the species level were verified by performing NCBI-BLAST2 (Basic Local Alignment Search Tool). Primers that target the invA gene for Salmonella were selected which produce fragment lengths around 285bp (shown in Figure 1). The Salmonella spp. solutions were tested and proved contained the sequences of invA gene by using several steps of molecular techniques before used it as inoculums in composting. The laboratory scale batch composting reactors were used to examine the inactivation of Salmonella spp. The inoculate solution of Salmonella was prepared by culturing Salmonella enteritidis (ATCC13076) in tryptone broth solution for 24 hours before adding it directly into the compost material. The reduction rate of Salmonella spp. was enumerated by conventional method accordingly to the standard compost guidelines (Figure 2). The laboratory scale study showed that after composting for 8 days the numbers of Salmonella spp. were below the limits in the UK compost standard (PAS 100) which requires the compost to be free of Salmonella spp.

研究の動機と目的

• 堆肥化におけるサルモネラの従来の検出法の限界、例えば感度の低さや、培養不能な可動性（VBNC）細胞の検出不能を克服すること。
• NCBI-BLAST2を用いたinvA遺伝子プライマーのサルモネラ種レベルにおける特異性を検証すること。
• 堆肥化実験の前段階で、インoculum溶液にサルモネラが存在することを確認する信頼性のある分子的手法を確立すること。
• 分子的および従来の定量法を用いて、ラボスケール堆肥化反応器におけるサルモネラ属の不活化動態を評価すること。
• 8日間の堆肥化が、英国PAS 100基準によるサルモネラの基準値未満に病原体を低下させることを確認すること。

提案手法

• サルモネラ属特異的プライマーを用いて、約285 bpの断片を生成するようにinvA遺伝子をPCR増幅する。
• NCBI-BLAST2を用いてゲノム配列との相同性を確認し、種レベルでの検出精度を保証する。
• トライプトンブロスでサルモネラ・エンテリチディス（ATCC13076）を24時間培養し、インoculum溶液を調製する。
• ゲル電気泳動および配列解析により、インoculum中のinvA遺伝子の存在を分子的に確認する。
• 制御された条件下でラボスケール反応器を用いてバッチ型堆肥化実験を実施する。
• PAS 100指針に準拠した従来のプレート法を用いてサルモネラの減少を定量する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 VBNC状態または低濃度にあっても、invA遺伝子を標的にするPCRは、堆肥化インoculumにおけるサルモネラ属を信頼性高く検出できるか？
• RQ2 選択されたinvA遺伝子プライマーは、サルモネラ属の種レベルでどの程度特異的であり、その特異性はどのように検証されたか？
• RQ3 ラボスケール堆肥化プロセスにより、8日間でサルモネラ集団が英国PAS 100基準値未満に低下するか？
• RQ4 invA遺伝子の分子的確認は、堆肥化における病原体不活化研究の信頼性をどのように向上させるか？
• RQ5 分子的法と従来法の併用は、堆肥化におけるサルモネラの定量精度をどの程度向上させるか？

主な発見

• invA遺伝子特異的プライマーは、サルモネラ・エンテリチディスから約285 bpの断片を効果的に増幅し、インoculumに標的遺伝子が存在することを確認した。
• NCBI-BLAST2解析により、選択されたプライマーがサルモネラ属に特異的であり、非標的生物との非特異的反応が最小限に抑えられていることが確認された。
• 分子的技術により、サルモネラインoculumにinvA遺伝子が存在することが検証され、堆肥反応器への一貫した病原体導入が保証された。
• 8日間の堆肥化後、サルモネラ集団は英国PAS 100基準で要求される検出限界未満にまで低下した。
• 分子的確認と従来のプレート法の併用により、堆肥化プロセスにおける病原体不活化の強固な証拠が得られた。
• 本研究では、従来法がVBNC状態や低細胞数のため失敗する可能性がある状況において、PCRなどの分子的技術が、堆肥化における病原体追跡の正確性を確保するために不可欠であることが示された。