[論文レビュー] Multiplexed plasmonic nanoantennas for high throughput single molecule nanoscale dynamics in living cells

Pamina M. Winkler, Thomas S. van Zanten+2 more|arXiv (Cornell University)|Jan 28, 2022

Plasmonic and Surface Plasmon Research被引用数 4

ひとこと要約

本研究では、sCMOS検出と統合された多重化プラズモン性ナノアンテナを用いて、生きた細胞膜におけるナノスケール分解能で高スループットの単分子トラッキングを実現した。1 kHzで同時に225個のアンテナインボックス構造を調査することで、1ミリ秒未満の時間分解能と1 nmの軸方向局在精度を達成し、単分子動態研究における逐次的調査のスループット制限を克服した。

ABSTRACT

Single molecule detection has revolutionised the fields of chemistry and biology by offering powerful ways to study individual molecules under different scenarios. Nanophotonic structures, including plasmonic antennas, significantly overcome the concentration limit at which single molecule events can be observed, enabling their detection at concentrations that are relevant to biological and chemical processes. Although antennas can be fabricated in large arrays, probing dynamic events requires high temporal resolution, which is best achieved by serial antenna interrogation. Unfortunately, this precludes the simultaneous recording from multiple antennas at different sample locations, and is time consuming, resulting in poor statistics and low-throughput data acquisition, abating the true potential of arrays. Here we exploit arrays of antenna-in-box nanostructures in combination with sCMOS readout to interrogate nanoscale volumes from 225 antennas simultaneously. Recording at 1 kHz allowed multiplexed dynamic measurements from 50 nanoantennas simultaneously with a temporal resolution dictated by the camera framerate and the photons emitted per molecule during a single passage. We demonstrate the capability for high-throughput arrayed detection of single molecule dynamics at the nanoscale in the membrane of living cells, and determine the axial location of membrane molecular components with 1 nm accuracy and temporal resolution below 1 ms.

研究の動機と目的

• 生きた細胞における逐次的単分子検出の低スループットを克服し、複数のプラズモン性ナノアンテナを同時に調査可能にする。
• 生きた細胞膜内の単分子をトラッキングする際の高い時間分解能とナノスケールの空間精度を達成する。
• 生理的濃度に近い条件下での動的分子プロセスをモニタリング可能なスケーラブルなアレイベースのプラットフォームを開発する。
• 並列検出により統計的パワーを向上させ、ナノスケールの分子ダイナミクスの定量的分析を可能にする。

提案手法

• ナノスケール体積におけるプラズモン場を閉じ込め強化するアンテナインボックスナノ構造のアレイを用いる。
• 1 kHzのフレームレートで単分子からの蛍光発光をsCMOSカメラを用いて記録する。
• 225個の個別ナノアンテナを同時にモニタリングすることで、多重検出を活用する。
• 一時的発光イベントからの単分子ダイナミクスを抽出するために、光子数カウントと時間相関解析を適用する。
• 軸方向位置を1 nmの精度で特定するために、光学伝達関数の正確なキャリブレーションを実施する。
• 生きた細胞における単分子の安定的で長期的な観察を可能にする独自のイメージングセットアップを導入する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 多重化プラズモン性ナノアンテナは、生きた細胞における単分子ダイナミクスの高スループット検出を可能にするか？
• RQ2 生きた細胞膜内で複数のナノアンテナを同時にモニタリングする場合、達成可能な時間分解能と軸方向局在精度は何か？
• RQ3 225個のナノアンテナを並列で調査することで、逐次的調査と比較して統計的パワーはどのように向上するか？
• RQ4 このプラットフォームを用いて、生物学的プロセスに相当する濃度での単分子ダイナミクスを定量的に分析できるか？
• RQ5 このアプローチを用いた膜に埋め込まれた分子のトラッキングにおける軸方向分解能と時間的忠実度の限界は何か？

主な発見

• システムは1 kHzのフレームレートで50個のナノアンテナを同時に検出でき、高スループットなデータ取得を実現した。
• キャリブレートされたプラズモン場分布を用いて、膜に埋め込まれた分子成分の軸方向局在を1 nmの精度で特定した。
• 1 ms未満の時間分解能を達成したが、これはsCMOSカメラのフレームレートと1分子あたりの光子放出に制限されていた。
• 従来の濃度制限を克服し、生物学的プロセスに相当する濃度での単分子ダイナミクスの観察が可能になった。
• 多重化アプローチにより、逐次的調査手法と比較して統計的パワーとデータ取得速度が顕著に向上した。
• プラズモン強化と並列読み出しを組み合わせることで、生きた細胞膜における単分子ダイナミクスの安定的で長期的なモニタリングが実証された。