[論文レビュー] Mutations on COVID-19 diagnostic targets

Rui Wang, Yuta Hozumi+2 more|arXiv (Cornell University)|May 5, 2020

SARS-CoV-2 and COVID-19 Research参考文献 7被引用数 7

ひとこと要約

本研究は2020年5月1日までに収集された7,818例のSARS-CoV-2ゲノムを分析し、特にヌクレオカプシド（N）遺伝子のプライマーおよびプローブを対象とした診断標的で広範な突然変異が生じていることを明らかにした。研究結果は、N遺伝子に特にある突然変異、特にN-China-F試薬において、世界的な診断精度が損なわれており、今後の診断法、ワクチン、治療法開発においてより保存領域の多いウイルス遺伝子を優先的に検討する必要があることを示している。

ABSTRACT

Effective, sensitive, and reliable diagnostic reagents are of paramount importance for combating the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic at a time there is no preventive vaccine nor specific drug available for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). It would be an absolute tragedy if currently used diagnostic reagents are undermined in any manner. Based on the genotyping of 7818 SARS-CoV-2 genome samples collected up to May 1, 2020, we reveal that essentially all of the current COVID-19 diagnostic targets have had mutations. We further show that SARS-CoV-2 has the most devastating mutations on the targets of various nucleocapsid (N) gene primers and probes, which have been unfortunately used by countries around the world to diagnose COVID-19. Our findings explain what has seriously gone wrong with a specific diagnostic reagent made in China. To understand whether SARS-CoV-2 genes have mutated unevenly, we have computed the mutation ratio and mutation $h$-index of all SARS-CoV genes, indicating that the N gene is the most non-conservative gene in the SARS-CoV-2 genome. Our findings enable researchers to target the most conservative SARS-CoV-2 genes and proteins for the design and development of COVID-19 diagnostic reagents, preventive vaccines, and therapeutic medicines.

研究の動機と目的

• SARS-CoV-2の突然変異が、現在使用されている診断試薬、特にN遺伝子を標的にするものに与える影響を評価すること。
• 診断の信頼性を損なう原因となる、最も突然変異を起こしやすいウイルス遺伝子およびタンパク質を同定すること。
• CDCおよびWHOが提供するような広く使用されている診断プライマーおよびプローブセットが、出現するウイルス変異体に対して果たす性能を評価すること。
• 今後の診断法、ワクチン、治療法開発の指針とするために、SARS-CoV-2遺伝子の保存性の順にランク付けすること。
• 中国製の特定の診断キットの失敗要因を、その標的領域における高い突然変異率と結びつけて説明すること。

提案手法

• GISAIDから2020年1月5日から5月1日までの間、7,818例の完全なSARS-CoV-2ゲノム配列を収集した。
• Clustal Omegaを用いてマルチプル・シークエンス・アラインメントを実施し、武漢由来の標準株（NC_004718）と比較して単一ヌクレオチド多型（SNPs）を同定した。
• SNPプロファイルのジャカード距離に基づき、k-meansクラスタリングを用いてウイルスゲノムを5つの異なる亜系統（I〜V）に分類した。
• 遺伝子ごとの突然変異率（遺伝子長あたりのSNPs数）を計算し、突然変異の頻度と凝集度を定量化するための新規指標「突然変異hインデックス」を導入した。
• 全5,117例のSNPsを41種類の一般的に使用されている診断プライマーおよびプローブセットにマッピングし、突然変異頻度と標的結合への影響を評価した。
• 統計解析を用いて、ウイルス遺伝子間での突然変異パターンを比較し、診断試薬の性能と相関をとった。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 現在の診断プライマーおよびプローブが標的にしているSARS-CoV-2遺伝子に、どの程度の突然変異が見られるか？
• RQ2 どのSARS-CoV-2遺伝子が最も高い突然変異率を示し、診断標的に最も不適切であると考えられるか？
• RQ3 特にN-China-F試薬におけるヌクレオカプシド（N）遺伝子の突然変異が、特定の診断キットの非効率性を説明できる程度はどの程度か？
• RQ4 突然変異hインデックスおよび突然変異率指標は、ワクチンおよび治療法開発のための最も保存領域の長いウイルス遺伝子を信頼性を持って同定できるか？
• RQ5 突然変異の分布および頻度は、異なる地理的地域やウイルス系統によってどのように変化するか？

主な発見

• 7,818例のSARS-CoV-2ゲノム全体にわたり、合計5,117例の単一ヌクレオチド多型（SNPs）が同定され、ウイルス全遺伝子にわたって分布していた。
• ヌクレオカプシド（N）遺伝子は、突然変異率が最も高く（0.2705）、突然変異hインデックスも最大（29）を記録し、最も非保存的かつ突然変異に脆弱な遺伝子であることが示された。
• 中国で使用されているN-China-F診断試薬では、全5つのウイルス亜系統にわたり8つの突然変異が確認され、臨床的検査で報告された非効率性の原因とされた。
• 世界的に広く使用されているCDCのN1およびN2プライマー／プローブセットに対しても、突然変異の影響が顕著に見られ、RT-PCR診断の信頼性が脅かされている。
• ORF3aおよびORF8タンパク質は、それぞれ2番目の高い突然変異率（0.2800および0.2479）を示し、高い変異性を示した。
• N遺伝子の高い突然変異率とそれに伴うプライマー／プローブの相違は、世界的な診断検査活動に深刻な影響を及ぼしており、今後の診断法およびワクチン開発における標的選定の再評価が不可欠である。