[論文レビュー] Nanopore Sequencing of the phi X 174 genome

Andrew H. Laszlo, Ian M. Derrington+11 more|arXiv (Cornell University)|Jun 17, 2014

Genomics and Phylogenetic Studies参考文献 1被引用数 3

ひとこと要約

本研究では、MspAポアを用いてバクテリオファージphi X 174ゲノムの長リード、シングルマoleculeナノポアシークエンシングを実施し、256種類の全4ヌクレオチド配列（クアドルマー）に対応するイオン電流レベルをマッピングすることで、最大4,500塩基のリードを明確にアラインメントすることに成功した。クアドルマー地図により、未知の配列の電流レベルを正確に予測可能となり、低コストで最小限のサンプル調製で実現可能なハイブリッドゲノムアセンブリおよび多様体検出のプロトタイプアプリケーションが可能となった。

ABSTRACT

Nanopore sequencing of DNA is a single-molecule technique that may achieve long reads, low cost, and high speed with minimal sample preparation and instrumentation. Here, we build on recent progress with respect to nanopore resolution and DNA control to interpret the procession of ion current levels observed during the translocation of DNA through the pore MspA. As approximately four nucleotides affect the ion current of each level, we measured the ion current corresponding to all 256 four-nucleotide combinations (quadromers). This quadromer map is highly predictive of ion current levels of previously unmeasured sequences derived from the bacteriophage phi X 174 genome. Furthermore, we show nanopore sequencing reads of phi X 174 up to 4,500 bases in length that can be unambiguously aligned to the phi X 174 reference genome, and demonstrate proof-of-concept utility with respect to hybrid genome assembly and polymorphism detection. All methods and data are made fully available.

研究の動機と目的

• 最小限のサンプル調製で長リード、シングルマolecule DNA解析が可能な高精度なナノポアシークエンシング法の開発。
• MspAナノポアにおける全256種類の4ヌクレオチド組み合わせに対応するイオン電流レベルの包括的クアドルマー地図の確立。
• phi X 174リファレンスゲノムを用いて、正確なゲノムアラインメント、ハイブリッドアセンブリ、多様体検出が可能であることを実証すること。

提案手法

• DNAがポア内を通過する際のイオン電流変化を、MspAナノポアでモニタリングした。
• 全256種類の可能な4ヌクレオチド配列（クアドルマー）の電流レベルを測定・キャリブレーションし、予測可能な電流マップを作成した。
• クアドルマー地図を用いて、通過中の特徴的な電流レベルに基づき未知のDNA配列をデコードした。
• phi X 174ゲノムから最大4,500塩基のナノポアシークエンシングリードを生成し、リファレンス配列にアラインメントした。
• 長リードの明確なアラインメントと既知の多様体の検出を示すことで、手法の正確性を検証した。
• 再現可能性およびさらなる開発を支援するため、すべての実験的手順、データ、補足資料を公開した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 クアドルマーに基づくイオン電流マップは、ナノポア通過中のDNA配列の正確なデコードを可能にするか？
• RQ2 最大4,500塩基の長ナノポアリードは、電流レベルのシグネチャを用いてリファレンスゲノムに明確にアラインメント可能か？
• RQ3 本アプローチによるナノポアシークエンシングは、ハイブリッドゲノムアセンブリおよび多様体検出を高信頼性で実現できるか？
• RQ4 クアドルマー地図は、測定済みでない未知のDNA配列の電流レベルをどの程度正確に予測できるか？
• RQ5 本手法は、最小限のサンプル調製と低コストの装置で高精度を達成できるか？

主な発見

• クアドルマー地図により、未知のDNA配列の電流レベルが高精度で予測可能となり、信頼性の高い配列デコードが可能となった。
• ナノポアシークエンシングにより、phi X 174リファレンスゲノムに明確にアラインメント可能な最大4,500塩基のリードが得られた。
• 本手法はハイブリッドゲノムアセンブリにおけるプロトタイプの有効性を示し、既存のアセンブリパイプラインと互換性があることが確認された。
• 多様体検出が成功裏に達成され、リファレンス配列内の既知の遺伝的バリアントに対する感受性が確認された。
• すべての実験データ、手法、補足資料が完全に公開され、再現性およびさらなる研究を促進した。