[論文レビュー] Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements - a worldwide benchmark study

Björn Hellenkamp, Sonja Schmid+51 more|arXiv (Cornell University)|Oct 10, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques被引用数 13

ひとこと要約

本国際的ベンチマーク研究では、標準化された染料標識DNA二重ヘリックスを用いて20の研究室で単分子FRET（smFRET）測定の正確性と正確性を評価した。FRET効率は標準偏差±0.02～±0.05の範囲で測定可能であり、補正済み光物理的パラメータを用いたFRET効率から正確な距離への変換プロトコルが妥当であることが示され、smFRETを用いた構造生物学における再現性と信頼性が著しく向上した。

ABSTRACT

Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) is increasingly being used to determine distances, structures, and dynamics of biomolecules in vitro and in vivo. However, generalized protocols and FRET standards ensuring both the reproducibility and accuracy of measuring FRET efficiencies are currently lacking. Here we report the results of a worldwide, comparative, blind study, in which 20 labs determined the FRET efficiencies of several dye-labeled DNA duplexes. Using a unified and straightforward method, we show that FRET efficiencies can be obtained with a standard deviation between $Δ$E = +-0.02 and +-0.05. We further suggest an experimental and computational procedure for converting FRET efficiencies into accurate distances. We discuss potential uncertainties in the experiment and the modelling. Our extensive quantitative assessment of intensity-based smFRET measurements and correction procedures serve as an essential step towards validation of distance networks with the ultimate aim to archive reliable structural models of biomolecular systems obtained by smFRET-based hybrid methods.

研究の動機と目的

• 複数の独立した研究室におけるsmFRET測定の再現性と正確性を評価すること。
• 強度に基づくsmFRET測定における主要な不確実要因を同定および定量すること。
• 補正済み光物理的パラメータを用いたFRET効率から正確な距離への変換を可能にする標準化された、普遍的に適用可能なプロトコルを確立すること。
• smFRETの信頼性を向上させるための妥当なフレームワークを提供すること。

提案手法

• 同一の染料標識DNA二重ヘリックスを用いて、20の独立した研究室が参加する世界規模の盲検比較研究を実施した。
• ドナーとアクセプターの光子数からFRET効率を計算するための統一的で簡単な手法を採用した。
• 量子収率（ΦD）、ドナーおよびアクセプターの消光係数（εD、εA）、スペクトル重なり（J）、および配向因子（κ²）を含む光物理的パラメータの補正手順を適用した。
• 回転平均化の評価およびκ² = 2/3の妥当性を検証するために、時間分解済みアニュリスロピー測定を実施した。
• 誤差伝搬を用いて各パラメータの不確実性寄与度を計算し、フォーラス半径R0における総不確実性はR0の≤7%と推定した。
• β要因ネットワークの自己整合性チェックおよびモデル距離との比較により、結果の妥当性を検証した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 標準化されたサンプルを用いた多様な研究室間でのsmFRET効率測定の再現性はいかほどか？
• RQ2 光物理的パラメータ（ΦD、εD、εA、J、κ²）の不確実性は、smFRETにおける距離計算の正確性にどのように影響するか？
• RQ3 実験的およびモデル化の仮定（例：等方的双極子配向、固定された染料位置）は、FRET距離の正確性にどの程度影響を与えるか？
• RQ4 標準化された補正プロトコルを用いることで、smFRETを用いた距離測定のばらつきは著しく低減され、正確性は向上するか？

主な発見

• 20の研究室でFRET効率が±0.02～±0.05の範囲で測定され、高い再現性が示された。
• フォーラス半径R0における不確実性はR0の≤7%と推定され、主な寄与度はκ²（±5%）、J（±2.5%）、ΦD（±2%）、εA（±2%）であった。
• 定常状態アニュリスロピー値が0.2未満の場合、等方的双極子配向（κ² = 2/3）の仮定が妥当であると検証された。
• 時間分解済みアニュリスロピー測定により、回転相関時間が十分に速いためκ² = 2/3を仮定することが妥当であり、残渣アニュリスロピー値は0.1未満であった。
• Atto647Nなどの良好に特徴付けられた染料の使用により不確実性が低減され、プロトコルが異なる実験設定に対しても頑健であることが示された。
• 本研究では、正確なsmFRET距離測定を可能にする妥当な、普遍的に適用可能なフレームワークが提供された。これはハイブリッド構造モデリングにとって不可欠である。