[論文レビュー] Quantifying the Bicoid morphogen gradient in living fly embryos

Julien Dubuis, Alexander H. Morrison+2 more|arXiv (Cornell University)|Mar 29, 2010

Cell Image Analysis Techniques参考文献 34被引用数 5

ひとこと要約

本研究では、Bcd-eGFP転換性Drosophila胚を用いて、早期発生期におけるリアルタイムでのBicoid形態形成因子濃度の絶対的測定を可能にする定量的2光子顕微法を開発・応用した。主な貢献は、生体内でのタンパク質ダイナミクスを定量する強固で誤差補正されたフレームワークであり、核内と細胞質内Bcdレベルの間に強い線形関係（R² = 0.89、勾配 4.12 ± 0.2）が存在することを明らかにした。これにより、体節形成カスケードの正確な動的モデリングが可能となった。

ABSTRACT

In multicellular organisms, patterns of gene expression are established in response to gradients of signaling molecules. During fly development in early Drosophila embryos, the Bicoid (Bcd) morphogen gradient is established within the first hour after fertilization. Bcd acts as a transcription factor, initiating the expression of a cascade of genes that determine the segmentation pattern of the embryo, which serves as a blueprint for the future adult organism. A robust understanding of the mechanisms that govern this segmentation cascade is still lacking, and a new generation of quantitative measurements of the spatio-temporal concentration dynamics of the individual players of this cascade are necessary for further progress. Here we describe a series of methods that are meant to represent a start of such a quantification using Bcd as an example. We describe the generation of a transgenic fly line expressing a Bcd-eGFP fusion protein, and we use this line to carefully analyze the Bcd concentration dynamics and to measure absolute Bcd expression levels in living fly embryos using two-photon microscopy. These experiments have proven to be a fruitful tool generating new insights into the mechanisms that lead to the establishment and the readout of the Bcd gradient. Generalization of these methods to other genes in the Drosophila segmentation cascade is straightforward and should further our understanding of the early patterning processes and the architecture of the underlying genetic network structure.

研究の動機と目的

• 早期Drosophila胚における形態形成因子濃度ダイナミクスを定量的・生体内で測定する手法を確立すること。
• 非常に高い精度と低い誤差で、生きた胚におけるBicoid（Bcd）タンパク質の絶対的濃度を測定すること。
• 生体イメージングにおける測定ノイズの原因を同定し、信頼性の高い定量的データを保証すること。
• 今後、Drosophilaにおける体節形成遺伝子ネットワーク全体の動的・定量的解明を可能にすること。

提案手法

• 生体イメージングを可能にするBicoid-eGFP融合タンパク質を発現するトランスジェニックDrosophila系統の作成。
• 信号対ノイズ比を向上させるために、同時エピおよび透過型蛍光検出を実施したカスタム2光子レーザー走査顕微鏡の使用。
• タイムラプス画像スタックの正確な制御と取得を実現するためのScanImageソフトウェアの採用。
• 高数値孔径の25×、0.8 NAレンズを用いた、自動化された核セグメンテーションおよび強度定量。
• ブートストラップ法と制御された摂動（例：核中心のずれ、焦点面の変動）を用いて、画像取得、核同定、アライメントのノイズを定量する誤差解析の実装。
• キャリブレーション曲線と光劣化制御を用いて、蛍光強度と絶対的Bcd濃度の相関を確立。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 生きたDrosophila胚における、前後軸に沿ったBicoidタンパク質の絶対的濃度は何か？
• RQ2 早期胚発生期における核内と細胞質内Bcdレベルの相関関係は何か？
• RQ3 生体イメージングにおける蛍光形態形成因子の測定ノイズの主な要因は何か？
• RQ4 生体内測定から、Bicoid勾配の定量的・動的モデルを構築できるか？
• RQ5 生体内タンパク質濃度測定の精度を体系的に向上・検証する方法は何か？

主な発見

• 核内Bcd濃度は細胞質濃度と線形相関を示し、勾配は4.12 ± 0.2（R² = 0.89）であり、強固なリーディングメカニズムであることが示された。
• 画像ノイズは全測定誤差の約10％を占め、焦点面調整ノイズは約5％を占める。
• 光劣化はイメージングセッション全体で1–2％に抑えられ、信号の減少を最小限に抑えた。
• エピおよび透過型蛍光検出の併用により、エピオンリーオンリーディングに比べ、信号対ノイズ比が約2倍向上した。
• ブートストラップ法と制御された摂動を用いて、測定誤差を画像取得、核同定、焦点面、回転非対称性の各成分に体系的に分解した。
• 本手法により、生きた胚におけるBicoid濃度の絶対的定量が可能となり、厳密な統計的妥当性に基づいた誤差棒の推定が可能となった。