[論文レビュー] Quantitative study of crossregulation, noise and synchronization between microRNA targets in single cells

Carla Bosia, Francesco Sgrò+7 more|arXiv (Cornell University)|Mar 23, 2015

Gene Regulatory Network Analysis被引用数 25

ひとこと要約

本研究では、定量的単細胞フローサイトメトリーと確率的チトラーションモデルを用いて、マイクロルナ（miRNA）標的が共有されるmiRNAプールへの競合的結合を通じて、クロスレギュレーション、ノイズ制御、同期化を示すことを実証した。主な発見では、クロスタッチが生理的mRNAレベル（約10–100分子／細胞）で最大となり、最適な化学计量比が二峰性発現を誘導し、強い相関関係を示すことが判明し、単細胞におけるmiRNA媒介遺伝子調節のモデルが裏付けられた。

ABSTRACT

Recent studies reported complex post-transcriptional interplay among targets of a common pool of microRNAs, a class of small non-coding downregulators of gene expression. Behaving as microRNA-sponges, distinct RNA species may compete for binding to microRNAs and coregulate each other in a dose-dependent manner. Although previous studies in cell populations showed competition in vitro, the detailed dynamical aspects of this process, most importantly in physiological conditions, remains unclear. We address this point by monitoring protein expression of two targets of a common miRNA with quantitative single-cell measurements. In agreement with a detailed stochastic model of molecular titration, we observed that: (i) crosstalk between targets is possible only in particular stoichiometric conditions, (ii) a trade-off on the number of microRNA regulatory elements may induce the coexistence of two distinct cell populations, (iii) strong inter-targets correlations can be observed. This phenomenology is compatible with a small amount of mRNA target molecules per cell of the order of 10-100.

研究の動機と目的

• 生理的条件下における単細胞内でのmiRNA標的のクロスレギュレーションの動的挙動を調査すること。
• miRNAと標的mRNA間の化学计量比がクロスタッチ、ノイズ、同期化に与える影響を特定すること。
• 確率的チトラーションモデルが、哺乳類細胞におけるタンパク質発現と相関関係の実験的観察を正確に予測できるかを検証すること。
• 複数の標的によるmiRNAの競合的チトラーションが、タンパク質発現の二峰性集団分布の出現に寄与する仕組みを解明すること。

提案手法

• 二つの蛍光標識miRNA標的のタンパク質発現を、コトランスフェクションした哺乳類細胞で定量的単細胞フローサイトメトリーを用いて測定した。
• 翻訳、結合、分解動態を含む、二つの標的mRNAに対するmiRNA媒介チトラーションを記述するための確率的化学マスター方程式モデルを構築した。
• マスター方程式のガウス近似により、5種の分子種における平均タンパク質レベルとノイズ（変動係数）の解析的計算が可能になった。
• モーメント生成関数法を用いて、平均ベクトルと共分散行列を記述する20本の連立方程式系を導出し、数値的に解けるようにした。
• 実験的検証には、二方向性プラスミドを用い、蛍光レポーターを二重に持ち、変動するmiRNA調節領域（MRE）のコピー数を組み込んだ。
• モデル予測を、タンパク質発現のピアソン相関係数と変動係数（CV）を含む実験データと比較した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 単細胞内でのmiRNA標的間のクロスレギュレーションが顕著になる化学计量比の条件は何か？
• RQ2 標的mRNA上のmiRNA調節領域（MRE）の数がタンパク質発現のノイズと相関関係に与える影響は何か？
• RQ3 複数の標的によるmiRNAの競合的チトラーションが、タンパク質発現の二峰性集団分布の出現に寄与するか？
• RQ4 実験的観察によるタンパク質の相関関係とノイズが、確率的チトラーションモデルの予測とどの程度一致するか？
• RQ5 内因性mRNA分子数の観点から、miRNA標的のクロスレギュレーションの生理的意義は何か？

主な発見

• miRNA標的間のクロスレギュレーションは、1細胞あたり10～100分子の生理的mRNAレベルに達した際に最大に達する。
• 標的に対するmiRNA調節領域（MRE）数のトレードオフが、高発現状態と低発現状態の二つの異なる細胞集団の出現を引き起こす。
• miRNAの再結合閾値付近では、標的間の強い相関関係（非調節コントロールに比べ最大12倍の相関上昇）が観察され、モデルの予測と整合的である。
• タンパク質発現のノイズ（CV）はMREコピー数に依存する：mCherryのCVはmCherryのMRE数に応じて上昇するが、mCeruleanのMRE数に応じて低下するため、非対称な調節が示唆される。
• mCherryの蛍光強度に二峰性分布がMRE数の閾値を超えて出現し、競合的miRNAチトラーションによってスイッチ型挙動が駆動されていることが示された。
• 確率的チトラーションモデルは、平均タンパク質レベルと相関ダイナミクスの両方を正確に予測でき、ガウス近似によりモーメントの信頼性ある推定が可能である。