[論文レビュー] Raman spectroscopic detection of rapid, reversible, early-stage inflammatory cytokine-induced apoptosis of adult hippocampal progenitors/stem cells

Uma Ladiwala, Aseefhali Bankapur+3 more|arXiv (Cornell University)|Jan 29, 2014

Spectroscopy Techniques in Biomedical and Chemical Research参考文献 41被引用数 4

ひとこと要約

本研究では、ラマン分光法と光トラップを組み合わせることで、プロインフレマトリー接着性サイトカインTNF-αおよびIFN-γの作用によって誘発された、成人海馬前駆細胞／幹細胞における10分以内の急速で可逆的な初期アポトーシスを検出することに成功した。抗炎症性サイトカインIL-10は、サイトカイン暴露の前後どちらのタイミングでもこれらの変化を逆転させ、細胞の脆弱性と修復可能性の一時的ウィンドウを明らかにした。

ABSTRACT

The role of neuro-inflammation in diverse, acute and chronic brain pathologies is being increasingly recognized. Neuro-inflammation is accompanied by increased levels of both pro- and anti-inflammatory cytokines; these have deleterious as well as protective/reparative effects. Inflammation has varying effects on neurogenesis and is a subject of intense contemporary interest. We show that TNF-alpha and IFN-gamma, used concomitantly, cause apoptosis of adult rat hippocampal progenitor/stem cells in vitro as detected by the TUNEL and MTT assays on time scales of several hours. We have coupled Raman spectroscopy to an optical trap to probe early changes of apoptosis in single, live neural stem cells that have been treated with pro-inflammatory cytokines, TNF-alpha and IFN-gamma. Changes caused by inflammation-induced denaturation of DNA are observed in the Raman spectra that correspond to very early stages of apoptosis, occurring on very fast time scales: as short as 10 minutes. Addition of the anti-inflammatory cytokine IL-10 either 10-30 min before or 10-30 min after treatment with TNF-alpha and IFN-gamma reverses the changes substantially. Our findings imply that inflammation can induce very rapid changes leading to cell death but that these are reversible, in the early stages at least.

研究の動機と目的

• 成人海馬前駆細胞／幹細胞に対するプロインフレマトリー接着性サイトカインの早期で可逆的な影響を調査すること。
• ラベルフリーで非侵襲的なラマン分光法を用いて、ミトコンドリア以前の変化を検出することにより、アポトーシスの早期変化を同定すること。
• 抗炎症性サイトカインIL-10が、早期の炎症誘発アポトーシスを逆転させる可能性を評価すること。
• 炎症シグナルへの動的細胞応答をモニタリングするためのリアルタイムで単一細胞レベルの手法を確立すること。
• 一時的で可逆的なアポトーシスの意義が、神経新生および神経炎症状態における脳修復に与える影響を検討すること。

提案手法

• 単一で生きたラット成人海馬前駆細胞／幹細胞を用い、ラマン分光計と光トラップを組み合わせた細胞操作および安定化を実施した。
• 炎症性アポトーシスを誘発するために、TNF-αおよびIFN-γの組み合わせを用いて処理した。
• 時間分解能を有するラマンスペクトルを取得し、特にDNA変性に関連する分子的変化を検出する。
• IL-10をサイトカイン処理の10～30分前または後に投与し、可逆性を評価した。
• アポトーシスの妥当性を確認するため、DNA断片化を検出するTUNEL法と代謝能を評価するMTT法を用いた。
• ピーク強度および位置の変化、特にDNAおよび核酸構造に関連する1300–1400 cm⁻¹領域の変化を分析した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 ラマン分光法は、炎症性サイトカインの作用開始後数分以内に神経幹細胞における初期アポトーシスを検出可能か？
• RQ2 TNF-αおよびIFN-γが神経幹細胞に誘発する分子的変化は、IL-10投与によって可逆的か？
• RQ3 分子レベルでの炎症誘発アポトーシスの可逆的である時間窓はどの程度か？
• RQ4 ラマンスペクトルの変化は、TUNELやMTTといった既存のアポトーシスマーカーと相関するか？
• RQ5 ラベルフリーで単一細胞レベルのラマン分光法は、神経前駆細胞における神経炎症応答をリアルタイムでモニタリング可能か？

主な発見

• TNF-αおよびIFN-γの併用処理後10分以内に、ラマン分光法でDNA構造に関連する初期アポトーシスの変化を検出でき、非常に急速な発症を示した。
• 特に1300–1400 cm⁻¹領域のスペクトル変化は、初期アポトーシスの特徴であるDNA変性を示唆した。
• サイトカイン処理後10～30分以内にIL-10を投与したことで、ラマンスペクトルの変化が顕著に逆転した。これは機能的可逆性を示した。
• 分子的変化の可逆性は、ラマン分光法およびTUNEL・MTT法による検証によって裏付けられた。
• 本研究では、一時的で可逆的なアポトーシスの段階が存在し、神経保護的介入のための治療的ウィンドウを示唆した。
• ラマン分光法と光トラップの組み合わせにより、単一細胞レベルでのリアルタイムで非侵襲的な動的細胞応答のモニタリングが可能となった。