[論文レビュー] Rapid and Accurate Detection of SARS-CoV-2 Mutations using a Cas12a-based Sensing Platform

Cai He, Chung‐Chih Lin+15 more|arXiv (Cornell University)|Oct 25, 2021

CRISPR and Genetic Engineering参考文献 11被引用数 4

ひとこと要約

本研究では、RT-PCR後の10分未満で蛍光またはリバーサブルフロー読み取りを用いて、SARS-CoV-2スパイク変異（例：N501Y、D614G、69/70欠失）を迅速かつ感受性・特異性を兼ね備えた検出が可能な、Cas12aを基盤とするCRISPRセンシングプラットフォームRT-CORDSを提示する。この手法は、シーングィングと比較して100％の正確性を示し、検出限界は6コピー/μL（10⁻¹⁷ M）に達し、臨床的変異監視にスケーラブルなツールを提供する。

ABSTRACT

The increasing prevalence of SARS-CoV-2 variants with spike mutations has raised concerns owing to higher transmission rates, disease severity, and escape from neutralizing antibodies. Rapid and accurate detection of SARS-CoV-2 variants provides crucial information concerning the outbreaks of SARS-CoV-2 variants and possible lines of transmission. This information is vital for infection prevention and control. We used a Cas12a-based RT-PCR combined with CRISPR on-site rapid detection system (RT-CORDS) platform to detect the key mutations in SARS-COV-2 variants, such as 69/70 deletion, N501Y, and D614G. We used type-specific CRISPR RNAs (crRNAs) to identify wild-type (crRNA-W) and mutant (crRNA-M) sequences of SARS-CoV-2. We successfully differentiated mutant variants from wild-type SARS-CoV-2 with a sensitivity of $10^{-17}$ M (approximately 6 copies/$μ$L). The assay took just 10 min with the Cas12a/crRNA reaction after a simple RT-PCR using a fluorescence reporting system. In addition, a sensitivity of $10^{-16}$ M could be achieved when lateral flow strips were used as readouts. The accuracy of RT-CORDS for SARS-CoV-2 variant detection was 100% consistent with the sequencing data. In conclusion, using the RT-CORDS platform, we accurately, sensitively, specifically, and rapidly detected SARS-CoV-2 variants. This method may be used in clinical diagnosis.

研究の動機と目的

• 新規変異における臨床的に重要なSARS-CoV-2スパイク変異を迅速かつ正確かつスケーラブルに検出する手法を開発すること。
• リアルタイムでワイルドタイプと変異株のSARS-CoV-2を区別できる、ポインツーオブケア診断の緊急的ニーズに対応すること。
• 低コストかつ高特異性の検出プラットフォームを提供することで、現場での使用に適した形で、アウトブレイクの迅速な追跡と感染制御を可能にすること。

提案手法

• RT-CORDSプラットフォームは、ワイルドタイプ（crRNA-W）および変異株（crRNA-M）SARS-CoV-2配列を標的にするタイプ特異的crRNAを用いた、逆転写（RT）とCRISPR-Cas12aベース検出を統合する。
• Cas12aはcrRNAでプログラムされ、標的結合時にレポーター・プローブを切断し、リアルタイムで蛍光信号を発生させる。
• 本システムは、定量的検出のための蛍光レポートシステムまたはリソース制限のある環境での可視的読み取りのためのリバーサブルフローストリップを用いる。
• 本手法は標準的なRT-PCR増幅工程の後に適用され、高い感受性と特異性を確保する。
• 検出は、活性化されたCas12aのコラテラル切断活性に依存しており、信号増幅と低検出限界を実現する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 CRISPR-Cas12aベースのプラットフォームは、迅速なフォーマットで、重要なSARS-CoV-2スパイク変異を高い感受性と特異性で検出可能か？
• RQ2 RT-CORDSプラットフォームは、変異検出においてゴールドスタンダードのサンジャーシーングィングと比較して、正確性に優れているか？
• RQ3 蛍光およびリバーサブルフローストリップ読み取りを用いた場合、変異株SARS-CoV-2配列の検出限界は何か？
• RQ4 本プラットフォームは、最小限の設備と訓練でポインツーオブケア用途に適応可能か？

主な発見

• 蛍光読み取りを用いた場合、RT-CORDSプラットフォームは10⁻¹⁷ M（約6コピー/μL）の検出限界を達成し、高い感受性を示した。
• リバーサブルフローストリップ読み取りを用いた場合、検出限界は10⁻¹⁶ Mであり、可視的検出フォーマットでも優れた性能を示した。
• 本手法はサンジャーシーングィングのデータと100％一致し、ワイルドタイプと変異株SARS-CoV-2を区別する高精度性を確認した。
• RT-PCR後の検出は10分未満で完了し、臨床的および公衆衛生的用途に向けた迅速なターンアラウンドを可能にした。
• 変異特異的crRNAを用いて、N501Y、D614G、および69/70欠失の主要な変異を効果的に区別できた。