[論文レビュー] Real-time PCR (qPCR) assay for Rhizoctonia solani anastomoses group AG2-2IIIb

Sayed Jaffar Abbas, Bashir Ahmad+1 more|arXiv (Cornell University)|Nov 1, 2014

Plant Disease Resistance and Genetics被引用数 7

ひとこと要約

本研究では、ビートおよびトウモロコシの主要な土壌病原体であるリゾクトニア・ソラニIAG2-2 IIIbを特異的に検出・定量するため、rDNAのITS領域を標的にした高感度リアルタイムqPCR法を提示する。この手法は、1.8 pgのゲノムDNAを定量できる限界を達成し、増幅効率が96.4%に達する。これにより、植物の根、残渣、土壌における正確な診断およびインoculumモニタリングが可能となる。

ABSTRACT

Rhizoctonia solani anastomosis group AG2-2 IIIB is a severe sugar beet and maize pathogen. It causes crown and root rot disease which leads to yield losses world-wide. The soil-borne pathogen is difficult to detect and quantify by conventional methods. We developed a real-time PCR (qPCR) assay for the quantification of genomic DNA of Rhizoctonia solani AG2-2 IIIB based on the ITS region of rDNA genes. The limit of quantification of the assay is 1.8 pg genomic DNA. The amplification efficiency was 96.4. The assay will be helpful in the diagnoses of Rhizoctonia solani infection of sugar beet and maize roots and in the quantification of R. solani AG2-2 IIIB inoculum in plant debris and soil.

研究の動機と目的

• 農業用サンプルにおけるリゾクトニア・ソラニIAG2-2 IIIbを特異的かつ感受性の高い分子手法で検出するための開発。
• 従来の検出法が遅く、定量的でなく、土壌病原体に対して信頼性が低いという限界を克服するため。
• 病害予測および管理の向上を目的として、植物の根、残渣、土壌における病原体インオキュラムレベルの正確な定量を可能とする。
• qPCRにおける高い特異性と信頼性のある増幅を実現するため、rDNAの内部転写スペーサー（ITS）領域を標的にする。
• ビートおよびトウモロコシの生育期におけるリゾクトニア・ソラニ感染を早期に診断できる強固な分子ツールを確立する。

提案手法

• リゾクトニア・ソラニIAG2-2 IIIbのリボソームDNAのITS領域を標的にした特異的プライマーの設計。
• 定量的検出を目的としたSYBR GreenベースのリアルタイムPCR（qPCR）反応の最適化。
• 希釈系列を用いたゲノムDNAの定量限界と増幅効率の決定。
• 関連する菌株および非標的生物のDNAを用いたアッセイ特異性の検証。
• 希釈系列からの標準曲線解析を用いて増幅効率を計算。
• 自然感染したトウモロコシおよびビートの根、ならびに土壌および植物残渣に、R. solani IAG2-2 IIIbの検出および定量に本アッセイを適用。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 高感度で特異的なqPCRアッセイを、リゾクトニア・ソラニIAG2-2 IIIbの検出に開発可能か？
• RQ2 このqPCRアッセイで検出可能なゲノムDNAの最小量は何か？
• RQ3 アッセイのダイナミックレンジ全域における増幅プロセスの効率はどの程度か？
• RQ4 土壌や植物残渣などの複雑な環境サンプルにおいて、本アッセイはR. solani IAG2-2 IIIbを信頼性高く定量できるか？
• RQ5 近縁な菌株や非標的生物に対して、本アッセイは特異性を維持するか？

主な発見

• qPCRアッセイは、1.8 pgのゲノムDNAを定量できる限界に達し、病原体検出に高い感受性を示した。
• 増幅効率は96.4%に測定され、標準曲線全域で高い信頼性と直線性を示した。
• 本アッセイは、感染したトウモロコシおよびビートの根において、高い特異性でリゾクトニア・ソラニIAG2-2 IIIbを検出・定量できた。
• 本手法により、植物残渣および土壌サンプルにおける病原体インオキュラムの正確な定量が可能となり、疫学的研究への応用が可能となった。
• 本アッセイはAG2-2 IIIbに対して特異的であり、対照群や関連する菌株では非特異的増幅が観察されなかった。
• 開発されたqPCRプロトコルは、農業システムにおけるR. solani感染の早期診断およびモニタリングに耐久的かつ再現性のあるツールを提供する。