[論文レビュー] Sampling the proteome by emerging single-molecule and mass-spectrometry methods

Michael J. MacCoss, Javier A. Alfaro+3 more|arXiv (Cornell University)|Jul 31, 2022

Advanced Proteomics Techniques and Applications被引用数 9

ひとこと要約

本稿は、哺乳類のプロテオームをサンプリングするための新興の単分子および質量分析法を評価しており、タンパク質分子の数がmRNA分子の数に比べて約30,000倍多いという広大な動的範囲の挑戦に焦点を当てている。LC-MS/MSで用いられる戦略、例えば標的指向の分離やデータ非依存分析が単分子プロテオミクスに応用可能であり、高感度かつ広い動的範囲で数百億個のタンパク質分子のスケーラブルな定量を可能にすると示している。

ABSTRACT

Mammalian cells have about 30,000-fold more protein molecules than mRNA molecules. This larger number of molecules and the associated larger dynamic range have major implications in the development of proteomics technologies. We examine these implications for both liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and single-molecule counting and provide estimates on how many molecules are routinely measured in proteomics experiments by LC-MS/MS. We review strategies that have been helpful for counting billions of protein molecules by LC-MS/MS and suggest that these strategies can benefit single-molecule methods, especially in mitigating the challenges of the wide dynamic range of the proteome. We also examine the theoretical possibilities for scaling up single-molecule and mass spectrometry proteomics approaches to quantifying the billions of protein molecules that make up the proteomes of our cells.

研究の動機と目的

• 哺乳類のプロテオームをサンプリングする課題に取り組む。これはタンパク質分子の数がmRNA分子の数に比べて約30,000倍多いからである。
• 既存のLC-MS/MS戦略が単分子プロテオミクス法にどのように適合可能かを評価すること。
• 単分子および質量分析法のアプローチが、細胞内プロテオームの全動的範囲を定量する上で理論的にどの程度スケーラブルかを評価すること。
• 現在の単分子法における主な技術的ボトル neck を特定し、ハイ・スループットなLC-MS/MSワークフローにインspiredされた解決策を提案すること。
• 単分子と質量分析技術の両者の原則を統合することで、より包括的かつ定量的なプロテオームサンプリングを可能にすること。

提案手法

• 哺乳類のプロテオームの動的範囲を分析し、mRNA分子に比べてタンパク質分子が約30,000倍多いと推定する。
• データ非依存分析（DIA）や標的プロテオミクスを含む、既に確立されたLC-MS/MS戦略を、プロテオミクスにおける広範な動的範囲の処理に用いる。
• LC-MS/MSの原則、例えばマルチプレックス標識やイオントモグラフィー分離を応用し、単分子カウントの感度とスループットを向上させる。
• 単分子フラーレッセンスやナノポアベース検出法などの単分子法が、低発現タンパク質の定量にどの程度有効かを評価する。
• 質量分析法の特異性と単分子検出の感度を組み合わせたハイブリッドワークフローを提案し、プロテオームカバレッジを向上させる。
• 理論的モデリングを用いて、単分子およびMSベースのアプローチの両方が、全プロテオーム定量に向けてどの程度スケーラブルかを予測する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 既存のLC-MS/MS戦略は、どのようにして単分子プロテオミクスの動的範囲と感度を向上させることができるか？
• RQ2 単分子法が、哺乳類細胞内のタンパク質分子の全量を定量するという点で、理論的な限界はどこにあるか？
• RQ3 単分子カウントは、ハイ・スループットなLC-MS/MSと同等の定量的正確性とカバレッジを達成できるか、その程度はどの程度か？
• RQ4 プロテオームの動的範囲と発現分布が、現在の単分子検出技術にどのような制限をもたらすか？
• RQ5 単分子法と質量分析法を統合する戦略は、プロテオームサンプリングの効率と深さを最大限に高めることができるか？

主な発見

• 哺乳類のプロテオームには、mRNA分子に比べて約30,000倍多いタンパク質分子が存在し、包括的なサンプリングには大きな課題をもたらしている。
• LC-MS/MS法は、通常、1回の実験で数百億個のタンパク質分子を測定でき、DIA や標的定量技術を活用している。
• LC-MS/MSで用いられる戦略、例えば安定同位体ラベル、分画分離、イオンモビリティ分離は、単分子プロテオミクスの向上に適合可能である。
• 単分子法は低発現タンパク質の検出に有望であるが、現在のところLC-MS/MSのスループットと動的範囲には及ばない。
• 単分子の感度と質量分析法の特異性を組み合わせたハイブリッドアプローチにより、全プロテオームのスケーラブルかつ定量的なサンプリングが可能になる可能性がある。
• 理論的モデルから、最適化されたワークフローを用いれば、単分子法およびMSベースのアプローチの両方が、細胞内プロテオームの全動的範囲を定量するのにスケーラブルであると示唆されている。