[論文レビュー] Sequencing single-stranded libraries on the Illumina NextSeq 500 platform

Johanna L. A. Paijmans, Sina Baleka+5 more|arXiv (Cornell University)|Nov 29, 2017

Genomics and Phylogenetic Studies参考文献 1被引用数 34

ひとこと要約

この論文は、Illumina NextSeq 500 プラットフォームにおける一本鎖DNAライブラリのシーケンシングの最適化を図り、2.2 pMのローディング濃度と1 mm²あたり最大250 k/mm²のクラスターデンシティを推奨することで、高いデータ品質（80％以上がフィルターパassing）を維持しながら収量を向上させた。独自に開発したインデックスリード2プライマー（Gesaffelstein）を導入し、QubitとTapestationを用いた正確なライブラリ定量を強調することで、一貫性のある結果を実現した。

ABSTRACT

Single-stranded libraries generated from ancient DNA extracts have specific sequencing requirements. The short library molecules typically associated with ancient DNA templates are expected to behave differently during the annealing to the flow cell and subsequent cluster generation (bridge PCR), requiring optimisation of loading amounts to obtain optimal and consistent cluster densities. For the past 3 years, we have carried out sequencing of single-stranded libraries on the Illumina NextSeq 500 sequencing platform at the Institute for Biochemistry and Biology, University of Potsdam. We report our optimisations here. This document may be useful for other researchers wishing to sequence single-stranded libraries on the NextSeq 500 platform. It does not replace the excellent documentation provided by Illumina (links provided below), but rather serves as additional information specific to single-stranded libraries. The original papers describing the library protocol should also be studied in detail, and complement the information presented here.

研究の動機と目的

• Illumina NextSeq 500 プラットフォームで一本鎖DNAライブラリをシーケンシングする際の低クラスターユーザーと一貫性のないデータ品質の課題を解決すること。
• Illuminaのデフォルトの推奨事項を超えて、一本鎖ライブラリのローディング濃度とクラスターデンシティを最適化すること。
• 二重インデックス化された一本鎖ライブラリのための効果的なインデックスリード2シーケンシングプライマー（Gesaffelstein）を開発・検証すること。
• qPCRを用いず、QubitとTapestationを用いた信頼性の高い、再現性のある一本鎖ライブラリの定量法を確立すること。
• 古代DNAや劣化したDNAサンプルをNextSeq 500でシーケンシングする研究者に実用的で検証済みのワークフローを提供すること。

提案手法

• 二重インデックス化された一本鎖ライブラリのためのインデックスリード2シーケンシングプライマーとして、独自に設計した5’-3’配列（Gesaffelstein: GGA AGA GCG TCG TGT AGG GAA AGA GTG T）を用いた。
• Illuminaの推奨濃度（1.8 pM）よりも高い2.2 pMのローディング濃度を適用し、短い一本鎖DNAテンプレートのクラスタ形成を改善した。
• Illuminaの推奨範囲（129–165 k/mm²）を超える250 k/mm²までクラスターデンシティを最適化し、データ品質の低下を最小限に抑えた。
• Qubit HS DNA Assay（10 µL以上）とAgilent TapestationのD1000 High-Sensitivity ScreenTapeを用いて、ライブラリ濃度の測定とモーダル断片長の推定を実施した。
• モーダル断片長とQubit濃度に基づいてモル濃度を計算し、ライブラリプールにqPCRを用いない方法を採用した。
• 定量精度のコントロールとして、Qubit BR Assay Standard #2（約50 ng/µL）を1:2に希釈した溶液を用いた。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 Illumina NextSeq 500 において、一本鎖ライブラリのクラスターユーザーとデータ品質を最大化する最適なローディング濃度は何か？
• RQ2 一本鎖ライブラリにおいて、データ品質が劣化する前にまでクラスターデンシティをどの程度まで引き上げられるか？
• RQ3 Illumina NextSeq 500 で効果的な二重インデックスシーケンシングを実現するための、必要なカスタムシーケンシングプライマーは何か？
• RQ4 QubitとTapestationを用いてqPCRを用いずとも、信頼性のあるライブラリ定量が可能か？
• RQ5 ライブラリ濃度と断片長分布が、一本鎖ライブラリのシーケンシングにおけるクラスターデンシティの一貫性にどのように影響するか？

主な発見

• 1.8 pMの標準濃度よりも2.2 pMでローディングすることで、特に短い古代DNA断片において、クラスタ形成が顕著に改善された。
• 250 k/mm²までのクラスターデンシティでも、両方のチャスティティおよびq30フィルターを通過するクラスターデータが80％以上を維持しており、高いデータ品質が保証された。
• クラスターデンシティが約250 k/mm²まで上昇するに従い、データ収量はほぼ直線的に増加したが、200–250 k/mm²を超えるとわずかな低下が観察された。
• 独自に開発したインデックスリード2プライマー（Gesaffelstein）により、通常のプライマーでは失敗する二重インデックス化された一本鎖ライブラリのシーケンシングが効率的に可能になった。
• モーダル断片長とQubit濃度に基づくモル濃度推定をQubitとTapestationで行うことで、qPCRを必要とせず、一貫性があり予測可能なクラスターデンシティが得られた。
• 初期濃度が2.5 nM未満のライブラリでは、一貫性のないシーケンシング結果が得られたため、信頼性のあるプールイングの実用的下限が存在することが示された。