[論文レビュー] Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview

Thierry Rabilloud, Laurent Vuillard+2 more|PubMed|Nov 23, 2009

Advanced Proteomics Techniques and Applications参考文献 7被引用数 202

ひとこと要約

本論文は、ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質可視化のための銀染色法について包括的な概説を提供し、銀アンミンおよび銀ナイトレート錯体に基づく手法を評価している。銀ナイトレートを用いたプロトコルが、特に薄いゲルや小分子ペプチドに対してより普遍的かつ再現性が高く、速度、感度、さまざまな電気泳動システムとの適合性の面でトレードオフを示していることが明らかになった。

ABSTRACT

On the basis of the physico-chemical principles underlying silver-staining of proteins, which are recalled in this paper, several methods of silver-staining of proteins after SDS electrophoresis in polyacrylamide gels or isoelectric focusing were tested. The most valuable protocols are presented in this report, including standard methods for unsupported gels and new methods devised for thin (0.5 mm) supported gels for SDS electrophoresis or isoelectric focusing and for staining of small peptides. Generally speaking, the most rapid methods were found to be less sensitive and less reproducible than more time-consuming ones. Among the long methods, those using silver-diammine complex gave the most uniform sensitivity. They require however special home-made gels and cannot be applied to several electrophoretic systems (e.g. systems using tricine or bicine as the trailing ion, or isoelectric focusing in immobilized pH gradients). For these reasons, protocols based on silver nitrate are of a more general use and might be favored. Future trends for silver-staining will also be discussed.

研究の動機と目的

• ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質検出のためのさまざまな銀染色プロトコルの性能を評価・比較すること。
• 薄い（0.5 mm）サポート付きゲルおよび等電点ゾーン電気泳動に用いられるゲルを含む、さまざまなゲルタイプに最適な感受性と再現性の高い手法を特定すること。
• 銀染色法が、トレーラーイオンとしてトリシンまたはビシンを用いる電気泳動システムなど、多様な電気泳動システムとどの程度適合するかを評価すること。
• プロテオミクスおよび分子生物学の研究室で日常的に使用可能な実用的で最適化されたプロトコルを提供すること。
• 銀染色技術の今後の動向について、タンパク質検出の感度と信頼性の向上に焦点を当てて議論すること。

提案手法

• 銀アンミン錯体の生成とポリアクリルアミドゲル内での銀ナイトレートの還元に基づく銀染色プロトコルの評価。
• 非サポートゲルへの標準的手法の適用および、薄い（0.5 mm）サポート付きゲル向けの新規プロトコルの開発。
• SDS-PAGEおよび等電点ゾーン電気泳動（IEF）システムへの染色法の適用。
• 時間最適化型および延長型プロトコルを含む、複数のプロトコルにおける感度と再現性の評価。
• 銀イオンの結合および還元の物理化学的原則を根拠に、手法選定および最適化を支援すること。
• トリシンおよびビシンを用いるシステムを含む、さまざまなゲルタイプおよび電気泳動条件における染色結果の比較。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 どの銀染色プロトコルが、ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質検出において最高の感受性と再現性を示すか？
• RQ2 時間最適化型プロトコルは、より長時間・複雑なプロトコルに比べて、感度と一貫性においてどの程度優れているか？
• RQ3 銀アンミンを用いた手法は、トリシンまたはビシンをトレーラーイオンとして用いる標準的な電気泳動システムとどの程度適合するか？
• RQ4 SDS-PAGEおよび等電点ゾーン電気泳動に用いられる薄い（0.5 mm）サポート付きゲル向けに、効果的な銀染色プロトコルを開発できるか？
• RQ5 銀アンミンを用いた染色法の限界は何か？なぜ銀ナイトレートを用いた手法がより広く適用可能なのであるか？

主な発見

• 最も迅速な銀染色プロトコルは、より長時間・高負荷のプロトコルに比べて感受性が低く、再現性も劣っていた。
• 銀アンミン錯体を用いたプロトコルは、均一な感受性を示したが、特別に調整されたゲルを必要とし、特定の電気泳動システムとは適合しなかった。
• 銀ナイトレートを用いたプロトコルは、より普遍的に適用可能であり、一般の研究室での使用に適していることが判明した。
• 薄い（0.5 mm）サポート付きゲル用に、効果的な新規プロトコルが開発された。これにより、SDS-PAGEおよび等電点ゾーン電気泳動における検出が可能になった。
• 最適化された銀染色法により、小分子ペプチドの染色が効果的に実現され、この技術の応用範囲が拡大された。
• 銀染色技術の今後の動向は、感度・再現性の向上および多様な電気泳動システムとの適合性の向上に注目が集まると予想される。