[論文レビュー] Simultaneous multiplane imaging with reverberation multiphoton microscopy

Devin R. Beaulieu, Ian G. Davison+2 more|arXiv (Cornell University)|Dec 12, 2018

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 24被引用数 3

ひとこと要約

本論文では、従来の multiphoton microscopy ハードウェアを用いて、ビデオレート速度で同時多平面 3D ボリュメトリックイメージングを可能にする、リバーブレーション multiphoton microscopy (RMPM) を紹介する。光学リバーブレーションを用いて近瞬時の軸方向スキャンを実現することで、RMPM は、特に低繰り返し周波数レーザーを用いた散乱組織においても、画像速度や性能を損なわずマイクロメートルスケールの 3D 分辨能を達成する。

ABSTRACT

Multiphoton microscopy (MPM) has gained enormous popularity over the years for its capacity to provide high resolution images from deep within scattering samples1. However, MPM is generally based on single-point laser-focus scanning, which is intrinsically slow. While imaging speeds as fast as video rate have become routine for 2D planar imaging, such speeds have so far been unattainable for 3D volumetric imaging without severely compromising microscope performance. We demonstrate here 3D volumetric (multiplane) imaging at the same speed as 2D planar (single plane) imaging, with minimal compromise in performance. Specifically, multiple planes are acquired by near-instantaneous axial scanning while maintaining 3D micron-scale resolution. Our technique, called reverberation MPM, is well adapted for large-scale imaging in scattering media with low repetition-rate lasers, and can be implemented with conventional MPM as a simple add-on.

研究の動機と目的

• 従来の multiphoton microscopy における 3D ボリュメトリックイメージングにおける根本的な速度制限を克服すること。
• 空間分解能を損なわず、高繰り返し周波数レーザーを必要とせずに、複数の光学平面を同時に取得すること。
• 標準的な multiphoton microscopy システムと互換性があり、大規模で深部組織イメージングに適した実用的で追加可能なソリューションを開発すること。
• 従来の手法が遅すぎて不適切な散乱生物試料においても、高いイメージング性能を維持すること。

提案手法

• 本手法は、励起レーザー光ビームの複数往復を維持するカスタム光学キャビティを採用し、時間的に分離されたパルス列を生成する。
• これらのパルスは、試料内の異なる軸方向深さで空間的に焦点化され、複数の平面での同時励起を可能にする。
• 軸方向スキャンは、キャビティ内でのレーザーパルスの往復時間によって実現され、機械的軸方向スキャンを光学遅延に置き換える。
• 低繰り返し周波数レーザー光源を用いることで、ハードウェアのアップグレードなしに標準的な multiphoton マイクロスコープと互換性を持つ。
• 画像再構成は、キャビティ内のパルスの時間的順序と同期させた検出によって行われ、異なる軸方向平面からの信号を区別可能にする。
• 複数の平面にわたっても、励起ビームのきつい焦点を維持することで、高い空間分解能を保つ。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 低分解能や速度の低下を伴わず、ビデオレート速度で多平面 3D イメージングが可能になるか？
• RQ2 光学リバーブレーションをどのように活用して、散乱試料における高速な軸方向スキャンを実現できるか？
• RQ3 高繰り返し周波数レーザーを必要とせず、既存の multiphoton マイクロスコープに簡単な追加部品として実装可能か？
• RQ4 リバーブレーションを用いた軸方向スキャンによる、達成可能な軸方向分解能とイメージング速度はどの程度か？
• RQ5 従来のスキャン手法と比較して、本手法は深部で散乱する生物学的組織において、どのように性能を発揮するか？

主な発見

• 本手法は、標準的な 2D 平面イメージングと同等の取得速度で、ビデオレート速度での同時多平面イメージングを達成する。
• マイクロメートルスケールの 3D 空間分解能が、深部で散乱する組織でさえも、複数の平面にわたって維持される。
• 低繰り返し周波数レーザーを用いても効果的に動作し、光傷害を低減するとともに、標準的な multiphoton マイクロスコープと互換性を持つ。
• 光学リバーブレーションの利用により、ほぼ瞬時の軸方向スキャンが実現され、機械的スキャンステージの必要性が排除される。
• 本システムは、特に散乱媒体において、大規模なボリュメトリックイメージング応用においても頑健な性能を示す。
• 本手法は、従来の multiphoton マイクロスコープシステムに簡単な追加部品として実装可能であり、最小限の改造で実現可能である。