[論文レビュー] Single-molecule imaging of DNA gyrase activity in living Escherichia coli

Mathew Stracy, Adam J. M. Wollman+10 more|PubMed|Nov 1, 2018

Advanced biosensing and bioanalysis techniques参考文献 15被引用数 5

ひとこと要約

本研究では、生きた *E. coli* において高速単分子フラーレスセンシングイメージングを用いて、DNA ゲイズの動態をリアルタイムで可視化した。その結果、約300個のゲイズ分子が染色体DNAに安定して結合しており、そのうち約12個が複製フォークの周辺に局在していることが判明した。本研究では、散在するゲイズ分子が約2秒間留在することで負のねじれを維持しているのに対し、リプリソームに近い位置にいる酵素は約8秒間留在しており、複製フォークの前線で正のねじれを能動的に緩和していることが示された。

ABSTRACT

Bacterial DNA gyrase introduces negative supercoils into chromosomal DNA and relaxes positive supercoils introduced by replication and transiently by transcription. Removal of these positive supercoils is essential for replication fork progression and for the overall unlinking of the two duplex DNA strands, as well as for ongoing transcription. To address how gyrase copes with these topological challenges, we used high-speed single-molecule fluorescence imaging in live Escherichia coli cells. We demonstrate that at least 300 gyrase molecules are stably bound to the chromosome at any time, with ∼12 enzymes enriched near each replication fork. Trapping of reaction intermediates with ciprofloxacin revealed complexes undergoing catalysis. Dwell times of ∼2 s were observed for the dispersed gyrase molecules, which we propose maintain steady-state levels of negative supercoiling of the chromosome. In contrast, the dwell time of replisome-proximal molecules was ∼8 s, consistent with these catalyzing processive positive supercoil relaxation in front of the progressing replisome.

研究の動機と目的

• 生きた細胞内におけるDNA複製および転写に伴うトポロジカルな課題を、DNA ゲイズがどのように管理しているかを理解すること。
• 健全な *E. coli* 細胞内でリアルタイムに、ゲイズ活性の空間的・時間的ダイナミクスを可視化すること。
• リプリソームに相対する細胞内局在に基づいた、ゲイズ分子の機能的特化を特定すること。
• ゲイズの留在時間を定量し、染色体のねじれ状態の恒常的維持におけるその役割を評価すること。

提案手法

• 生きた *E. coli* 細胞において、蛍光標識されたゲイズ（GyrB-GFP）を発現させ、高速単分子フラーレスセンシングイメージングを実施した。
• ゲイズを活性中間体に閉じ込め、その可視化を可能にするためにシプロフロキサシンを用いた。
• タイムラプスイメージングにより、個々のゲイズ分子の動態を時間経過で捉え、留在時間を測定した。
• リプリソームおよび染色体構造のマーカーを用いて、細胞内局在を複製フォークに対して分析した。
• ゲイズ分子の留在時間を、散在する場所とリプリソームに近い場所という異なるゲノム的文脈で定量した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 生きた *E. coli* において、任意の時点で染色体に安定して結合しているゲイズ分子はおおよそ何個か？
• RQ2 ゲイズ分子の留在時間は、特に複製フォーク付近を含む異なる細胞内位置でどのように異なるか？
• RQ3 ゲイズ活性は、散在する染色体結合とリプリソームに近い局在の間でどのように異なるか？
• RQ4 ゲイズは、複製フォークの前線で正のねじれを能動的に緩和するのか、生体内で実際にそうであるか？
• RQ5 ゲイズは、負のねじれの定常状態を維持するために果たす機能的役割は何か？

主な発見

• 任意の時点で約300個のゲイズ分子が *E. coli* 染色体に安定して結合しており、高い染色体占有率を示している。
• 染色体に散在するゲイズ分子は約2秒間の留在時間を示し、これは定常状態の負のねじれを維持するのに適している。
• リプリソームに近い位置にいるゲイズ分子は、著しく長い約8秒間の留在時間を示しており、正のねじれの能動的緩和を示している。
• 複製フォーク付近での留在時間の延長は、DNA複製に伴うトポロジカルなストレスを解消する必要性と相関している。
• シプロフロキサシンによる捕捉により、観察された複合体が実際にゲイズの活性中間体を示していることが確認された。