[論文レビュー] Structured Illumination in Spatial-Orientational Hyperspace

Karl Zhanghao, Xingye Chen+9 more|arXiv (Cornell University)|Dec 14, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 14被引用数 4

ひとこと要約

この論文は、空間的および角度的情報をスパティオ-angularハイパースペース内のドロップレットを分析することで分離する、偏光構造化照明顕微鏡（pSIM）を紹介する。この手法により、生きた細胞における細胞骨格ネットワーク、λ-DNA、微小小管などの細胞小器官構造の超解像像が得られ、アクチンリングの組織構造やダイナミックなドロップレット行動が直接商業的および自作のSIMシステムと互換性を保ったまま明らかにされる。

ABSTRACT

Fluorescence polarization microscopy images both the intensity and orientation of fluorescent dipoles, which plays a vital role in studying the molecular structure and dynamics of bio-complex. However, it is difficult to resolve the dipole assemblies on the subcellular structure and their dynamics in living cells with super-resolution. Here we report polarized structured illumination microscopy (pSIM), which decouples the entangled spatial and angular structured illumination through interpreting the dipoles in spatio-angular hyperspace. We demonstrate its application on a series of biological filamentous systems such as cytoskeleton networks and lambda-DNA, and report the dynamics of short actin sliding through myosin-coated surface. Further, pSIM reveals side-by-side organization of the actin ring structure in the membrane-associated periodic skeleton in hippocampal neurons. It also images the dipole dynamics of green fluorescent proteins labeled to the microtubules in live U2OS cells. pSIM can be applied directly to a large variety of commercial or home-built SIM systems.

研究の動機と目的

• 蛍光偏光顕微鏡における空間的および角度的情報の混同により、生きた細胞における分子の組織構造とダイナミクスを解像できないという課題を克服すること。
• 強度とドロップレット配向の両方において超解像を達成するために、空間的および配向的構造化照明を分離する手法を開発すること。
• 商業的および自作のSIMシステムへの直接適用を可能にし、生物学的顕微鏡法における広範なアクセス性を高めること。
• 細胞骨格ネットワーク、λ-DNA、微小小管などの細胞小器官構造を、解像度および配向感度を向上させた状態で可視化すること。
• 定量的偏光顕微法を用いて、生きた細胞におけるアクチンのスライディングやドロップレット再配向といった動的プロセスを研究すること。

提案手法

• pSIMは、スパティオ-angularハイパースペースにおける蛍光ドロップレットの解釈により、構造化照明の空間的および角度的成分を分離する。
• 従来の構造化照明顕微鏡（SIM）を拡張し、ドロップレット配向情報を抽出するために偏光感度を組み込む。
• 数学的フレームワークを用いて、フーリエ領域における空間周波数と角度分布の寄与を分離する。
• 2チャンネル検出方式を採用し、強度と偏光状態を同時に取得することで、完全なスパティオ-angular再構成を実現する。
• 再構成アルゴリズムは、既知のドロップレット放射パターンを活用し、回折限界を下回る解像度で配向と位置をデコードする。
• 標準的なSIMハードウェアに偏光感度検出を追加するだけで、主要なシステム設計の見直しが不要なため、標準SIMハードウェアと互換性がある。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 構造化照明顕微鏡は、生きた細胞において空間的および角度的（ドロップレット配向）情報を同時に解像できるか？
• RQ2 膜関連周期骨格におけるアクチン線維の隣接配置は、その構造的および機能的特性にどのように影響を与えるか？
• RQ3 GFP標識された微小小管におけるドロップレット配向のダイナミクスは、生きたU2OS細胞でどのように変化するか？
• RQ4 pSIMは、ミオシンマシンが駆動する短いアクチンスライディングイベントを十分な空間的および角度的精度で解像できるか？
• RQ5 pSIMは、ハードウェアの改造なしに、既存の商業的またはカスタム製SIMシステムにどの程度容易に実装可能か？

主な発見

• pSIMは、海馬ニューロンの膜関連周期骨格におけるアクチン線維の隣接配置を成功裏に解像し、以前に解明されていなかった構造的配列を明らかにした。
• この手法は、ミオシンでコーティングされた表面を横切る短いアクチンスライディングのダイナミクスを、回折限界を下回る空間的および角度的解像度で可視化した。
• pSIMは、生きたU2OS細胞におけるGFP標識された微小小管の再配向ダイナミクスを捉え、ドロップレット行動のリアルタイムモニタリングを実証した。
• スパティオ-angularハイパースペースにおける空間的および角度的情報を分離することで、細胞骨格ネットワークおよびλ-DNAの超解像像を実現した。
• pSIMは、ハードウェアの刷新なしに、広範な商業的および自作SIMシステムに直接適用可能であり、広範な採用を可能にした。
• この手法により、ドロップレット配向と強度を同時に定量的分析可能となり、蛍光顕微鏡から抽出される構造的および動的情報が著しく向上した。