[論文レビュー] Structured illumination microscopy for dual-modality 3D sub-diffraction resolution fluorescence and refractive-index reconstruction

Shwetadwip Chowdhury, Will J. Eldridge+2 more|arXiv (Cornell University)|Aug 15, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 71被引用数 43

ひとこと要約

本論文は、蛍光スーパーレゾリューションとコherentな合成開口鏡像法を統合することで、屈折率（RI）再構成を実現する構造化照明（SI）顕微鏡システムを提示している。この手法により、生きた細胞において分子的蛍光と生物学的物理的RI分布を同時に定量的可視化でき、F-アクチン染色を施したA549およびHT-29細胞を用いて、両モダリティで100 nm未塔の分解能を達成した。

ABSTRACT

Though structured illumination (SI) microscopy is a popular imaging technique conventionally associated with fluorescent super-resolution, recent works have suggested its applicability towards sub-diffraction coherent imaging with quantitative endogenous biological contrast. Here, we demonstrate that SI can efficiently integrate the principles of fluorescent super-resolution and coherent synthetic aperture to achieve 3D dual-modality sub-diffraction resolution, fluorescence and refractive-index (RI) visualizations of biological samples. Such a demonstration can enable future biological studies to synergistically explore molecular and biophysical/biochemical mechanisms at sub-diffraction resolutions. We experimentally demonstrate this framework by introducing a SI microscope capable of 3D sub-diffraction fluorescence and RI imaging, and verify its biological visualization capabilities by experimentally reconstructing 3D RI/fluorescence visualizations of fluorescent calibration microspheres as well as alveolar basal epithelial adenocarcinoma (A549) and human colorectal adenocarcinmoa (HT-29) cells, fluorescently stained for F-actin.

研究の動機と目的

• 蛍光および屈折率（RI）モダリティの両方で3次元サブディファクション分解能イメージングを実現できる単一の光学プラットフォームの開発。
• 既存のスーパーレゾリューション技術が分子特異的蛍光または内因性の生物学的物理的コントラストのいずれかに限定されているという制限を克服すること。
• サブディファクション分解能で分子構造（蛍光を介して）と生物学的物理的性質（RIを介して）を同時に可視化することで、生物学的知見を相乗的に得ること。
• 蛍光マイクロスフィアおよびがん細胞株（A549、HT-29）を用いた生物学的サンプルを用いて、フレームワークの妥当性を検証すること。

提案手法

• システムは、複数の角度で照明パターンを変調する構造化照明（SI）を用い、空間周波数の高さを向上させる合成開口合成を実現する。
• コherentなSIを用いて、フレネル核を用いたデジタル伝搬を活用し、回折トモグラフィー（DT）により3次元定量的位相（QP）および屈折率（RI）を再構成する。
• 蛍光スーパーレゾリューションは、標準的なSI顕微鏡の原則に従い、複数のパターン化照明を用いて、光学的ディファクション限界を超える周波数情報をシフト・デコードすることで達成される。
• 蛍光のための強度検出と、コherentイメージングのための複素電場検出を組み合わせることで、1回の取得シーケンスから両モダリティの共同再構成が可能となる。
• 蛍光およびコherentイメージングの3次元伝達関数（TF）をモデル化し、数値的NA、波長、検出角度に基づいて横方向および軸方向分解能の上限を定義する。
• 反復的位相回復および逆フィルタリングを用いた再構成アルゴリズムにより、記録された強度パターンから高分解能RIおよび蛍光分布を回復する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 構造化照明顕微鏡を用いて、蛍光および屈折率イメージングの両方で同時にサブディファクション分解能を達成できるか？
• RQ2 合成開口鏡像法と蛍光スーパーレゾリューションを統合することで、生物学的サンプルの二重モダリティ3次元イメージングがどのように可能になるか？
• RQ3 RI再構成は、物理的厚さと光学的パス長（OPL）をどの程度まで分離可能であり、定量的位相イメージングでは見えない生物学的に関連のある構造的詳細を明らかにできるか？
• RQ4 特にアポトーシスなどのプロセス中に、RIと蛍光分布は生きたがん細胞でどのように相関するか？
• RQ5 同じ光学システムおよび取得プロトコルによって、分子的（蛍光）および生物学的物理的（RI）パrameterの両方で定量的かつサブディファクション分解能のデータを取得できるか？

主な発見

• 本システムは、蛍光および屈折率イメージングの両方で3次元サブディファクション分解能を達成し、両モダリティで100 nm未塔の横方向分解能を実現した。
• 再構成されたRIマップは、細胞核や核小体よりも顕著に物理的厚さが小さいにもかかわらず、A549細胞に高RI局在を示した。
• 定量的位相イメージングだけでは、高RIによる高OPLと物理的厚さによる高OPLを区別できなかったが、RI再構成によりこれら2つの要因が一意に分離された。
• HT-29細胞では、膜のブレブおよび増加した高RI局在がアポトーシスと一致しており、RIおよび蛍光イメージングの両方で確認された。
• 蛍光イメージングではブレブ周辺で不規則なF-アクチン細胞骨格が観察されたが、RIイメージングでは密集した高RI構造が確認され、二重モダリティによる補完的構造的知見が得られた。
• 同じ細胞株内でも細胞間のRI分布にばらつきが観察されたことから、定量的イメージング研究において集団レベルの統計的解析の必要性が浮き彫りになった。