[論文レビュー] Synthesis, characterization, and biological evaluation of gelatin-based scaffolds

Giuseppe Tronci|arXiv (Cornell University)|Jan 9, 2011

Electrospun Nanofibers in Biomedical Applications被引用数 3

ひとこと要約

本研究では、泡立て法を用いたジイソシアネート架橋を介したコラーゲン由来ゲルラチンベースのスキャフォールドの合成と特性評価を報告している。この手法により、調整可能な多孔率（65–73 vol.％）と孔径（117–166 μm）が達成された。スキャフォールドは形状回復性、制御された分解性、完全な細胞接着性を示し、機械的安定性と低免疫原性を併せ持つことから、骨再生応用において強く有望である。

ABSTRACT

This thesis presents the development of entropy-elastic gelatin based networks in the form of films or scaffolds. The materials have good prospects for biomedical applications, especially in the context of bone regeneration. Entropy-elastic gelatin based hydrogel films with varying crosslinking densities were prepared with tailored mechanical properties. Gelatin was covalently crosslinked in water above its sol gel transition, which suppressed the gelatin chain helicity. Amorphous films were prepared with tailorable degrees of swelling and wet state Young's modulus. The knowledge gained with this bulk material was transferred to the integrated process of foaming and crosslinking to obtain porous gelatin-based scaffolds. A gelatin solution was foamed in the presence of saponin and the resulting foam was fixed by chemical crosslinking with a diisocyanate. The scaffolds were analyzed in the dry state by micro computed tomography (μCT, porosity: 65\pm 11-73\pm 14 vol.-%), and scanning electron microscopy (SEM, pore size: 117\pm 28-166 \pm 32 μm). After equilibration with water, the scaffolds were form-stable and displayed shape recovery after removal of mechanical loads. The composition dependent compression moduli (Ec: 10 50 kPa) were comparable to the bulk micromechanical Young's moduli, which were measured by atomic force microscopy (AFM). The hydrolytic degradation profile could be adjusted, and a controlled decrease of mechanical properties was observed. The scaffold cytotoxicity and immunologic responses were analyzed in vitro. Indirect eluate tests were carried out with L929 cells so that fully cytocompatible scaffolds were obtained. Furthermore, the material immune response was investigated in vitro. Minimal material endotoxin contamination was successfully achieved (<0.5 EU/mL) by using low-endotoxin gelatin and performing all synthetic steps in cleanroom.

研究の動機と目的

• 生体応用、特に骨再生を目的としたエントロピー弾性ゲルラチンベースのハイドロゲルネットワークの開発。
• 泡立てと化学的架橋を用いて、多孔率と孔径を制御可能な多孔性スキャフォールドの設計。
• 低エンドトキシンゲルラチンとクリーンルームでの合成を用いて、細胞接着性と最小限の免疫原性反応を確保。
• 架橋密度による機械的特性の調整と、形状回復性および分解挙動の評価。
• in vitroおよびin vivo試験に適したスケーラブルで生体適合性の高いスキャフォールドシステムの確立。

提案手法

• ゲルラチンを、そのソル-ゲル転移温度より高い温度で水溶液中でジイソシアネートを用いて共有結合で架橋し、ヘリシティを抑制するとともにエントロピー弾性ネットワークを形成。
• 界面活性剤としてサポニンを用いた泡立てプロセスを採用し、多孔性スキャフォールドの形成に適した安定な泡状前駆体を生成。
• 泡は化学的固定を経て乾燥され、多孔率および形態の評価にマイクロCTおよびSEMを用いて特性評価。
• 圧縮試験および原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、乾燥状態および湿潤状態での機械的特性を測定し、ヤング率および圧縮率を測定。
• L929線維芽細胞を用いた間接抽出液試験により細胞毒性を評価し、エンドトキシン濃度分析により免疫原性を評価。
• 水溶液条件下での分解挙動をモニタリングし、時間経過に伴う機械的特性の低下を評価。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 泡立て法を用いたゲルラチンの共有結合架橋は、組織工学に適した調整可能な多孔率および孔径を有する多孔性スキャフォールドを生成可能か？
• RQ2 架橋密度と機械的性能（例えばヤング率および圧縮率）との関係は何か？
• RQ3 作製されたスキャフォールドは、水分状態下でも形状回復性および形状安定性を示すか？
• RQ4 スキャフォールドは細胞の生存率をどの程度支持し、最小限の免疫原性反応を示すか？
• RQ5 スキャフォールドの分解プロファイルは、組織再生のスケジュールに合わせて制御可能か？

主な発見

• マイクロCTおよびSEMによる確認により、スキャフォールドの多孔率は65±11～73±14 vol.％、孔径は117±28～166±32 μmの範囲で達成された。
• 水分状態下でも、機械的負荷後に完全な形状回復が確認され、優れた弾性挙動を示した。
• 圧縮率（Ec）は10～50 kPaの範囲にあり、原子間力顕微鏡によるバルク微小機械的測定とよく一致した。
• スキャフォールドは制御された加水分解分解を示し、時間経過に伴い機械的特性が徐々に低下した。
• L929細胞を用いた細胞毒性試験により、間接抽出液試験で完全な細胞接着性が確認された。
• エンドトキシン濃度は0.5 EU/mL未満に維持され、低エンドトキシンゲルラチンとクリーンルームでの合成のおかげで、低免疫原性の可能性が示された。