[論文レビュー] The effect of shear stress reduction on endothelial cells : a microfluidic study of the actin cytoskeleton

Locatelli, L., Sinha, P.+1 more|arXiv (Cornell University)|Apr 1, 2020

Spaceflight effects on biology参考文献 60被引用数 51

ひとこと要約

本マイクロフルイディクス研究では、壁面せん断応力が0.4 Paから0.08 Paへ5倍減少した状態において、せん断応力に適応したヒトへその静脈内皮細胞（HUVECs）が、迅速にアクチン細.syskeletonを再編成する様子を調査した。1時間以内に、細胞はストレス線維を失い、アクチンを細胞周辺に集め、中心部が厚くなることが観察された。これは、より整列せず、丸みを帯びた形態に迅速に表型転換していることを示している。注目すべきは、ニューラミナーゼによるグリコカリックスの分解がストレス線維の整列に影響を及ぼさなかったことである。これは、アクチンの再編成が主に機械的刺激に依存しており、グリコカリックスに依存しないことを示唆している。

ABSTRACT

Reduced blood flow, as occurring in ischemia or resulting from exposure to microgravity such as encountered in space flights, induces a decrease in the level of shear stress sensed by the endothelial cells forming the inner part of blood vessels. In the present study, we use a microvasculature-on-a-chip device in order to investigate in vitro the effect of such a reduction in shear stress on shear-adapted endothelial cells. We find that, within one hour of exposition to reduced wall shear stress, human umbilical vein endothelial cells undergo a reorganization of their actin skeleton, with a decrease in the number of stress fibers and actin being recruited into the cells' peripheral band, indicating a fairly fast change in cells' phenotype due to altered flow.

研究の動機と目的

• 突然のせん断応力低下に対する、せん断応力に適応した内皮細胞の動的応答を調査すること。これは、虚血や微小重力状態を模倣する条件である。
• 生理的に妥当なマイクロバスクル・オン・ア・チップ系において、血流力学的力の低下に伴うアクチン細.syskeletonの整列変化を特定すること。
• グリコカリックスの分解が、せん断応力低下に対する細胞骨格応答に与える影響を評価し、グリコカリックスが機械的受容体として果たす役割を検証すること。

提案手法

• ソフトリソグラフィーとPDMSを用いて、16本の並列マイクロチャネル（断面積30×30 µm²）を有するマイクロバスクル・オン・ア・チップデバイスを製造した。
• 内皮細胞を96時間にわたり0.4 Paのせん断応力下で培養し、アテロプロテクティブな表型を確立した後、せん断応力を5倍低下させて0.08 Paにした。
• 流量を低下させることでせん断応力を5倍低下させ、細胞反応を1時間後に顕微鏡観察した。
• F-アクチンおよび核の染色を実施し、ニューラミナーゼを用いてグリコカリックスを分解し、スルホ酸残基を標的とした。
• 蛍光顕微鏡画像を取得し、アクチン分布、繊維の角度、蛍光強度の定量的分析を実施した。
• 数値シミュレーション（CFD）により、1 µL/min流量時におけるデバイス全体での均一な壁面せん断応力（0.4 ± 0.05 Pa）が確認された。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 0.4 Paのせん断応力に適応した内皮細胞において、せん断応力が5倍減少した場合、アクチン細.syskeletonの再編成はどのように変化するか？
• RQ2 せん断応力刺激の喪失は、内皮細胞の形態および細胞骨格の整列に、迅速な表型変化を引き起こすか？
• RQ3 グリコカリックスは、せん断応力低下時のストレス線維の整列を維持するために不可欠であるか、それとも応答は主に直接的な細胞骨格の機械的トランスダクションによって駆動されるか？
• RQ4 特に細胞周辺帯および細胞体における、アクチンの空間的分布は、せん断応力低下にどのように反応するか？
• RQ5 ニューラミナーゼ誘発によるグリコカリックスの分解は、せん断応力低下に対する細胞骨格応答を変化させるか？

主な発見

• 0.4 Paから0.08 Paへのせん断応力低下後1時間以内に、HUVECsは流れ方向に整列したストレス線維を顕著に失った。
• アクチンの再編成は迅速に進行し、F-アクチンのポリマー化が促進され、周辺帯にアクチンが集積した。これは、細胞骨格の再編成を示している。
• 細胞体の厚さが顕著に増加した。これは、細長い整列した表型から、より丸みを帯び、極性が低い形態への形態的転換を示している。
• ニューラミナーゼ処理によりグリコカリックスの蛍光強度が著しく低下したが、ストレス線維の数、方向性、分布に有意差は認められなかった。
• 繊維の角度分布およびアクチンの空間的整列は、対照群とグリコカリックス分解群との間に有意差がなく、細胞骨格応答がグリコカリックスの完全性に依存しないことを示している。
• 数値シミュレーションにより、1 µL/min流量時におけるマイクロチャネルネットワーク全体での均一な壁面せん断応力（0.4 ± 0.05 Pa）が確認され、実験設定の妥当性が裏付けられた。