[論文レビュー] The NAD(P)H:flavin oxidoreductase from Escherichia coli. Evidence for a new mode of binding for reduced pyridine nucleotides

Vincent Nivière, Franck Fieschi+2 more|PubMed|Jan 7, 2015

Bacterial Genetics and Biotechnology参考文献 34被引用数 41

ひとこと要約

本研究では、大腸菌由来NAD(P)H:フラビン酸化還元酵素（Fre）における還元ピリジンヌクレオチドの新しい結合モードを同定した。NADPHおよびNMNHは、通常のヌクレオチド結合タンパク質とは異なり、アデニル酸骨格ではなくピリジン環に主に結合していることが示された。酵素はピリジン環のC-4位置からのプロ-Ｒ水素を特異的に移動させることから、A側特異的酸化還元酵素としての分類が裏付けられ、一般的なピリジンヌクレオチド結合タンパク質とは異なる独自の基質認識を示している。

ABSTRACT

The NAD(P)H:flavin oxidoreductase from Escherichia coli, named Fre, is a monomer of 26.2 kDa that catalyzes the reduction of free flavins using NADPH or NADH as electron donor. The enzyme does not contain any prosthetic group but accommodates both the reduced pyridine nucleotide and the flavin in a ternary complex prior to oxidoreduction. The specificity of the flavin reductase for the pyridine nucleotide was studied by steady-state kinetics using a variety of NADP analogs. Both the nicotinamide ring and the adenosine part of the substrate molecule have been found to be important for binding to the polypeptide chain. However, in the case of NADPH, the 2'-phosphate group destabilized almost completely the interaction with the adenosine moiety. Moreover, NADPH and NMNH are very good substrates for the flavin reductase, and we have shown that both these molecules bind to the enzyme almost exclusively by the nicotinamide ring. This provides evidence that the flavin reductase exhibits a unique mode for recognition of the reduced pyridine nucleotide. In addition, we have shown that the flavin reductase selectively transfers the pro-R hydrogen from the C-4 position of the nicotinamide ring and is therefore classified as an A-side-specific enzyme.

研究の動機と目的

• 大腸菌由来NAD(P)H:フラビン酸化還元酵素（Fre）におけるピリジンヌクレオチド認識の分子的基盤を調査すること。
• NADPHおよびNMNHの異なる領域が結合親和性および触媒効率に与える構造的およびエネルギー的寄与を特定すること。
• Fre触媒反応における水素移動のステレオ化学的経路を解明すること。
• 通常のヌクレオチド結合タンパク質とは異なる、還元ピリジンヌクレオチドのFreにおける特異的結合モードを同定すること。
• NADPHの2'-リン酸基が酵素に対する基質親和性を調節する役割を同定すること。

提案手法

• 基質特異性および結合相互作用を調査するために、NADPアナログのパネルを用いた定常状態キネティクス分析を実施した。
• デュテリウムラベルを付加した基質を用いて、酵素のステレオ特異性を、水素移動のステレオ化学の分析により評価した。
• キネティクスデータおよび既知のヌクレオチド結合タンパク質との構造比較から、結合親和性および熱力学的パラメータを推定した。
• キナーゼおよび構造モデリングを用いて、ピリジン環およびアデニル酸骨格周辺のキモチカルな重要アミノ酸の基質認識における役割を解釈した。
• 遊離フラビンを電子受容体として用いて、Turnoverレートおよび基質Turnover効率を評価することで、酵素の触媒活性を測定した。
• NADPHの2'-リン酸基がアデニル酸結合に与える影響を、NMNHおよびNADPアナログとの比較キネティクスにより体系的に評価した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 還元ピリジンヌクレオチドが大腸菌Fre酸化還元酵素に結合する際の分子的決定要因は何か？
• RQ2 NADPHに存在する2'-リン酸基は、基質に存在するにもかかわらず、なぜアデニル酸部位との相互作用を不安定化させるのか？
• RQ3 Freはどのようにしてピリジン環C-4位置からのプロ-Ｒ水素を特異的に移動させるのか？
• RQ4 NADPHおよびNMNHがアデニル酸部分ではなくピリジン環に優先して結合する構造的根拠は何か？
• RQ5 Freの結合モードは、他のピリジンヌクレオチド依存性酸化還元酵素とはどのように異なるのか？

主な発見

• NADPHおよびNMNHは、アデニル酸骨格への寄与が最小限に抑えられる形で、主にピリジン環を介してFreに結合しており、特異的な結合モードであることが示された。
• NADPHの2'-リン酸基はアデニル酸領域との相互作用を顕著に不安定化させ、NMNHに比べて結合親和性を低下させている。
• Freはピリジン環C-4位置からのプロ-Ｒ水素を特異的に移動させることから、A側特異的酵素としての分類が裏付けられた。
• NADPHおよびNMNHの両方に対して高い触媒効率を示しており、ピリジン環が基質認識の主な決定要因であることが示された。
• 還元ピリジンヌクレオチドの結合モードは、通常のヌクレオチド結合タンパク質とは異なり、アデニル酸骨格が主役を占めるのではなく、Freではピリジン環が支配的である。
• 定常状態キネティクス分析により、NMNHの特異的定数（kcat/Km）がNADPHと同等であることが判明し、ピリジン環中心の結合モードが機能的に重要であることを裏付けた。