[論文レビュー] Tracking of individual freely diffusing fluorescent protein molecules in the bacterial cytoplasm

Brian P. English, Arash Sanamrad+3 more|arXiv (Cornell University)|Mar 10, 2010

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 28被引用数 5

ひとこと要約

本研究は、ストロボスコピックレーザー励起と確率的光活性化を組み合わせた超解像イメージング法を開発し、生きた細菌細胞内で個々のmEos2蛍光タンパク質分子を追跡した。通常の拡散（拡散係数：13.1 ± 1.2 μm²/s）を明らかにしたことで、細菌における細胞内ダイナミクスの単分子研究の基盤を確立した。

ABSTRACT

We combine stroboscopic laser excitation with stochastic photoactivation and super-resolution fluorescence imaging. This makes it possible to record hundreds of diffusion trajectories of small protein molecules in single bacterial cells with millisecond time resolution and sub-diffraction limited spatial precision. We conclude that the small protein mEos2 exhibits normal diffusion in the bacterial cytoplasm with a diffusion coefficient of 13.1 -+ 1.2 μm^2 s^(-1). This investigation lays the groundwork for studying single-molecule binding and dissociation events for a wide range of intracellular processes.

研究の動機と目的

• 生きた細菌細胞内で自由に拡散する個々の蛍光タンパク質を、高解像度かつリアルタイムで追跡することを可能にする。
• 密集した細胞内環境における単分子ダイナミクスを解像する点で、従来の蛍光顕微鏡法の限界を克服すること。
• ミリ秒時間分解能および準回折限界以下の空間分解能を用いて、細菌細胞質における小分子タンパク質の拡散行動を定量的に評価すること。
• 細胞内プロセスにおける単分子結合および解離反応を、堅牢なプラットフォームで研究すること。
• 単分子イメージング技術を用いて、原核細胞における分子移動性を分析するための定量的フレームワークを提供すること。

提案手法

• 蛍光タンパク質の活性化を時間的に制御するために、ストロボスコピックレーザー励起を用いた。
• 確率的光活性化と超解像蛍光イメージングを組み合わせ、個々の分子を分離して追跡した。
• ミリ秒時間分解能を有するタイムラプスイメージングを用いて、生きたE. coli細胞内でのmEos2の拡散軌跡を記録した。
• 単一蛍光分子の正確な局在を可能にする、回折限界を下回る空間分解能を適用した。
• ノイズの多い背景から個々の分子軌跡を抽出・解析するための画像処理を実装した。
• 追跡された軌跡の平均二乗変位（MSD）解析から、拡散係数を計算した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 密集した細菌細胞質内における小規模な蛍光タンパク質の拡散行動はいかなるものか？
• RQ2 生きた細菌細胞内において、ミリ秒時間分解能および準回折限界以下の空間分解能を達成した単分子追跡は可能か？
• RQ3 mEos2の拡散係数は、粘性の高い細胞内環境における自由拡散の理論的予測と比べてどのように異なるか？
• RQ4 細菌の細胞質は、小分子タンパク質の移動をどれほど制限するか、あるいは促進するか？
• RQ5 確率的光活性化とストロボスコピック励起は、生きた細胞内での個々の分子の信頼性の高い長期追跡を可能にするか？

主な発見

• 個々のmEos2分子は、細菌細胞質内で通常の（ブラウン運動的）拡散を示した。
• 単分子追跡を用いて、13.1 ± 1.2 μm²/sという高い精度でmEos2の拡散係数を測定した。
• 本手法により、ミリ秒時間分解能で数百個の個々の拡散軌跡を記録できた。
• 準回折限界以下の空間分解能を達成し、単一蛍光分子の正確な局在が可能になった。
• 本技術は、単分子レベルでの一時的結合および解離反応の研究に適していた。
• 結果は、mEos2が生きた細菌における単分子ダイナミクス研究の信頼できる蛍光プローブとして使用可能であることを裏付けた。