[論文レビュー] Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future

Rabilloud, Thierry, Chevallet, Mireille+2 more|arXiv (Cornell University)|Aug 16, 2010

Advanced Proteomics Techniques and Applications被引用数 371

ひとこと要約

このレビューは、2次元ゲル電気泳動（2D-GE）の発展を、プロテオミクスの出現期における基盤的役割から、現代のプロテオミクス研究における現在の限定的役割へとたどる。2D-GEが、固定化pH勾配と質量分析法による同定を支援することで、完全なタンパク質の高分解能分離を可能にしたことを詳述し、動的範囲と再現性の制限により、より感度が高くスループットの高い手法に取って代わられる中で、翻訳後修飾（PTM）の検出における持続的有用性を議論している。

ABSTRACT

Two-dimensional gel electrophoresis has been instrumental in the birth and developments of proteomics, although it is no longer the exclusive separation tool used in the field of proteomics. In this review, a historical perspective is made, starting from the days where two-dimensional gels were used and the word proteomics did not even exist. The events that have led to the birth of proteomics are also recalled, ending with a description of the now well-known limitations of two-dimensional gels in proteomics. However, the often-underestimated advantages of two-dimensional gels are also underlined, leading to a description of how and when to use two-dimensional gels for the best in a proteomics approach. Taking support of these advantages (robustness, resolution, and ability to separate entire, intact proteins), possible future applications of this technique in proteomics are also mentioned.

研究の動機と目的

• 2次元ゲル電気泳動の発展を、初期の実験的段階からプロテオミクスの創出における役割へと、年表的に記録すること。
• 2D-GEの再現性と感度に歴史的に制限をもたらした技術的課題、特にキャリアアミフォールのイソエレクトリックフォーカシングを分析すること。
• 固定化pH勾配（IPG）ストリップの導入が再現性を向上させ、国際的な研究所間比較を可能にした変革的影響を評価すること。
• 2D-GEとタンパク質マイクロアナリシス技術（エドマンシーケンシングや質量分析法）の統合が、タンパク質同定を可能にし、プロテオミクスの時代を開始したことを評価すること。
• 2D-GEの現在および将来の応用、特に翻訳後修飾および完全タンパク質種の検出における役割を特定すること。

提案手法

• 2D-GEの主要な出版文献と技術的マイルストーン、特にO'Farrellの1975年の論文とIPGストリップの導入を含む、歴史的分析を用いた。
• チューブゲルIEFにキャリアアミフォールを用いた技術的進化から、現代のIPGストリップへの移行をレビューし、pH勾配の安定性と再現性の向上に焦点を当てた。
• コアマスイーブブルー、シルバーステイン、およびオートラジオグラフィーを含む染色技術の役割を分析し、検出感度と画像品質の向上を評価した。
• 2D-GEとタンパク質同定技術（エドマンシーケンシングおよび質量分析法）の統合を評価し、ゲルスポットからのタンパク質同定を可能にした。
• タンパク質の酸化（例：ペルオキシレドキシンにおけるpIシフト0.25単位）や血浆タンパク質における脱アミド化などの翻訳後修飾の検出に2D-GEがどのように用いられたかを議論した。
• 解像度の向上を示すケーススタディおよび図を提示し、狭いpH勾配とマイクロプレアラティブな能力が、後続分析に向けた有効性を示した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 2次元ゲル電気泳動は、どのように一時的な技術からプロテオミクスの基盤的ツールへと進化したのであろうか？
• RQ2 初期の2D-GEにはどのような主な技術的制限があり、特に再現性と感度に影響を与えたのか。それらはどのように克服されたのであろうか？
• RQ3 2D-GEとタンパク質マイクロアナリシス技術の統合が、タンパク質同定とプロテオミクスの創出にどのように寄与したのであろうか？
• RQ4 ハイツループットでLC-MSに依存するプロテオミクスプラットフォームの台頭にもかかわらず、なぜ2D-GEは今日でも関連性を保っているのであろうか？
• RQ5 2D-GEの現在および将来の応用は、翻訳後修飾および完全タンパク質アイソフォームの検出において、どのようなものであろうか？

主な発見

• 1980年代後半に導入された固定化pH勾配（IPG）ストリップのおかげで、再現性が著しく向上し、研究所間比較が可能になり、キャリアアミフォールのボッチ間差によるばらつきが低減した。
• 2D-GEは、オートラジオグラフィーを用いて1枚のゲルで100以上のタンパク質スポットを検出可能であり、この画期的な成果が、この技術の高分解能ポentialを示した。
• この技術により、酸化によるシステイン51のpIシフト0.25単位といった、微細な翻訳後修飾の可視化が可能になった。シルバーステインで検出可能であった。
• マイクロプレアラティブ2D-GEにより、1枚のゲルからマウス肝ミトコンドリアタンパク質15 mgを隔離でき、質量分析法などの後続分析を支援した。
• 狭いpH勾配（例：5–6）は、幅広い勾配（4–8）で共移動していたアクチンアイソフォームのような近接して移動するタンパク質を解離でき、解像度の向上を実証した。
• 主流のプロテオミクス分野での使用が減少しているにもかかわらず、pIと分子量の両面からタンパク質を分離できる能力のおかげで、完全タンパク質および特定のPTM（例：脱アミド化、リン酸化）の検出において、2D-GEは依然として価値ある役割を果たしている。