[論文レビュー] Validation of Golden Gate assemblies using highly multiplexed Nanopore amplicon sequencing

Adán Andrés Ramírez Rojas, Cedric K. Brinkmann+1 more|arXiv (Cornell University)|Jan 25, 2024

Genomics and Phylogenetic StudiesBiochemistry, Genetics and Molecular Biology被引用数 3

ひとこと要約

本論文では、オックスフォード・ナノポアシーケンシングを用いて、部品ライブラリを用いた定義済みで検証済みの部品ではなく、複雑なゴールデンゲートアセンブリを検証するための、非常にマルチプレックス化され、二重バーコード化されたアンプリコンシーケンシングワークフローを提示する。この手法により、単一のコロニーから直接、包括的でコスト効率が良く、高スループットの検証が可能となり、最小限の作業時間と高い配列エラーまたはキメラの感受性を備えた正確で解釈可能なシーケンシングレポートを提供する。

ABSTRACT

Golden Gate cloning has revolutionized synthetic biology. Its concept of modular, highly characterized libraries of parts that can be combined into higher order assemblies allows engineering principles to be applied to biological systems. The basic parts, typically stored in level 0 plasmids, are sequence validated by the method of choice and can be combined into higher order assemblies on demand. Higher order assemblies are typically transcriptional units, and multiple transcriptional units can be assembled into multi-gene constructs. Higher order Golden Gate assembly based on defined and validated parts usually does not introduce sequence changes. Therefore, simple validation of the assemblies, e.g. by colony PCR or restriction digest pattern analysis, is sufficient. However, in many experimental setups, researchers do not use defined parts, but rather part libraries, resulting in assemblies of high combinatorial complexity where sequencing again becomes mandatory. Here we present a detailed protocol for the use of a highly multiplexed dual barcode amplicon sequencing using the Nanopore sequencing platform for in-house sequence validation. The workflow, called DuBA.flow, is a start-to-finish procedure that provides all necessary steps from a single colony to the final easy-to-interpret sequencing report.

研究の動機と目的

• 定義済みで検証済みの部品ではなく、部品ライブラリから生成された高複雑性のゴールデンゲートアセンブリを検証する課題に対処すること。
• ナノポアシーケンシングを用いた、自社で実施可能な、エンドツーエンドの簡素化されたゴールデンゲートアセンブリ検証ワークフローを開発すること。
• 組み合わせ的ゴールデンゲートコンストラクトにおける配列エラー、キメラ、意図しない再配置を、高スループットでコスト効率よく正確に検出できること。
• Sangerシーケンシングや低複雑性手法に依存せず、単一コロニーから直接、使いやすく解釈可能なシーケンシングレポートを提供すること。

提案手法

• 個々のコロニーおよびそのPCRアンプリコンを一意に特定するため、二重バーコード化された非常にマルチプレックス化されたアンプリコンシーケンシングを採用する。
• 複雑なアセンブリエラーを検出するのに適した長リードで高精度なシーケンシングデータを生成するため、オックスフォード・ナノポアシーケンシング技術を用いる。
• サンプルのデマルチプレキシング、リードの期待されるコンストラクトへのマッピング、および変異、キメラ、突然変異の同定を実行するカスタムバイオインフォマティクスパイプラインを適用する。
• 手作業ステップを最小限に抑え、組み合わせ的ゴールデンゲートアセンブリの迅速な検証を可能にする、コロニー1つからレポートへのワークフローを統合する。
• サンプルの混合を防ぎ、マルチプレックス化の能力とデータの信頼性を向上させるために二重バーコーディングを用いる。
• 最終レポートは、各アセンブルドコンストラクトの識別と忠実度を明確に示し、エラー検出とバリアントコールを含む。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 ナノポアシーケンシングを用いた非常にマルチプレックス化され、二重バーコード化されたアンプリコンシーケンシングアプローチは、部品ライブラリからの複雑なゴールデンゲートアセンブリを信頼性高く検証できるか？
• RQ2 本手法は、Sangerシーケンシングや制限酵素消化といった従来の検証手法と比較して、スループット、正確性、エラー検出においてどのように異なるか？
• RQ3 このワークフローは、組み合わせ的アセンブリにおけるキメラコンストラクト、点突然変異、誤った部品の融合をどの程度検出できるか？
• RQ4 本手法は、最小限のバイオインフォマティクスの専門知識を有する標準的な分子生物学ラボで実装可能か、外部のシーケンシングサービスに依存しないか？

主な発見

• 本手法により、1回のシーケンシング走行で何百ものゴールデンゲートアセンブリを同時に検証可能となり、Sangerシーケンシングと比較して大幅にスループットが向上した。
• 二重バーコード戦略により、サンプルの混合が効果的に防止され、高いマルチプレックス度においても正確なデマルチプレキシングが可能となった。
• このワークフローは、コロニーパクリングや制限酵素消化のみでは見逃されがちな、複雑なアセンブリにおける配列エラー、キメラ融合、誤った部品の組み合わせを正常に検出できた。
• 最終的なシーケンシングレポートは非常に解釈可能で、単一コロニーから直接、コンストラクトの識別と忠実度に関する明確で実行可能なデータを提供する。
• コロニー採取から最終レポートまでの全ワークフローは、最小限の作業時間と標準的な機器を用いて1つのラボで完了可能である。
• 本手法は低頻度のエラーおよびキメラに対して高い感受性を示し、高忠実度の合成生物学的応用に適していることが示された。