[論文レビュー] Watching Single Unmodified Enzymes at Work

Cuifeng Ying, Edona Karakaci+11 more|arXiv (Cornell University)|Jul 13, 2021

Protein Structure and Dynamics参考文献 40被引用数 9

ひとこと要約

本研究では、水溶液中で修飾を施さない酵素の構造的動態を1マイクロ秒未塔の時間分解能でモニタリングできる、プラズモンイクスを応用した単分子センシング技術を提案する。個々のタンパク質をプラズモン的ホットスポットに捕らえることで、アデニル酸キナーゼにおける隠れた触媒サブサイクル、シトレートシンアーゼの機能的に重要な中間体、ヘモグロビンにおける段階的遷移、および修飾なしにアポカルシウムジュリンにおけるドメイン特異的フォールディング経路が明らかになった。

ABSTRACT

Many proteins undergo conformational changes during their activity. A full understanding of the function of these proteins can only be obtained if different conformations and transitions between them can be monitored in aqueous solution, with adequate temporal resolution and, ideally, on a single-molecule level. Interrogating conformational dynamics of single proteins remains, however, exquisitely challenging and typically requires site-directed chemical modification combined with rigorous minimization of possible artifacts. These obstacles limit the number of single-protein investigations. The work presented here introduces an approach that traps single unmodified proteins from solution in a plasmonic hotspot and makes it possible to assign changes in refractive index to changes in protein conformation while monitoring these changes for minutes to hours with a temporal resolution at least as fast as 40 microseconds. The resulting single molecule data reveals that adenylate kinase employs a hidden enzymatic sub-cycle during catalysis, that citrate synthase populates a previously unknown intermediate conformation, which is more important for its enzymatic activity than its well-known open conformation, that hemoglobin transitions in several steps from its deoxygenated and rigid T state to its oxygenated and flexible R state, and that apo-calmodulin thermally unfolds and refolds in steps that correspond to conformational changes of individual protein domains.

研究の動機と目的

• 特異的標識を要する従来の単分子研究の限界を克服し、アーティファクトを回避すること。
• 溶液中で個々の未修飾タンパク質の構造的変化を長期的かつ高分解能でモニタリングできること。
• アンサンブル法や修飾済み単分子法では検出できない、一時的で機能的に重要なタンパク質状態を観察できること。
• 化学的修飾や固定化に起因するアーティファクトなしに、酵素ダイナミクスを一般化可能な方法で研究できること。

提案手法

• ナノ構造化された金基板が形成するプラズモン的ホットスポットにタンパク質を捕らえることで、局所的な高感度な電磁場を生成する。
• ホットスポット周辺の屈折率の変化を、プラズモン共鳴エネルギーのシフトとして検出することで、タンパク質の構造的変化を捉える。
• 本手法は少なくとも40マイクロ秒の時間分解能を達成しており、数分から数時間にわたるダイナミクスの観察が可能である。
• 本手法は水溶液中で動作し、タンパク質の天然状態を維持するとともに、化学的標識や表面固定化を不要とする。
• 校正および制御実験を通じて、屈折率の変化を構造的遷移と定量的に関連付ける。
• フォトリーディングやフォトブリンクイングの問題を伴わない、連続的な単分子モニタリングが可能である。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 未修飾酵素の構造的ダイナミクスを、溶液中でリアルタイムかつ高時間分解能でモニタリングできるか？
• RQ2 アンサンブル法では検出できない、酵素触媒過程中に存在する、未知のまたは一時的な構造的状態は存在するか？
• RQ3 ヘモグロビンやアポカルシウムジュリンにおける構造的遷移が、単一分子レベルでどのように進行するか？
• RQ4 カルシウムジュリンのような内在的無秩序性を示すまたはモジュラー構造を有するタンパク質において、タンパク質ドメインが独立して折りたたみ・展開する程度はどの程度か？
• RQ5 ラベルフリーで、化学的修飾なしに、プラズモンセンシングがシトレートシンアーゼやアデニル酸キナーゼのような酵素の機能的に重要な中間体を解明できるか？

主な発見

• アデニル酸キナーゼは、触媒過程中に従来検出されていなかった酵素サブサイクルを示しており、以前に知られていたよりも複雑な動態機構であることが示唆された。
• シトレートシンアーゼは、よく知られたオープン型よりも触媒活性がより高い、以前に未知の構造的中間体を形成していた。
• ヘモグロビンは、剛直で脱酸素化状態のT状態から、柔軟で酸素化状態のR状態への多段階的遷移を経ており、バッチ研究では解明されなかった中間状態が明らかになった。
• アポカルシウムジュリンは、ドメインごとの独立した遷移を示しながら段階的に折りたたみ・展開していた。
• 本手法により、未修飾タンパク質を数分から数時間にわたって、1マイクロ秒未塔の時間分解能で連続的にモニタリングできた。
• 観察された屈折率の変化は、構造的遷移と直接相関しており、本手法が構造的変化に対して感受性と特異性を有していることを確認した。