[논문 리뷰] Quantification of heparin in complex matrices (including urine) using a mix-and-read fluorescence assay

Ulrich Warttinger, Roland Krämer|arXiv (Cornell University)|2016. 11. 08.

Proteoglycans and glycosaminoglycans research참고 문헌 18인용 수 5

한 줄 요약

이 연구는 간단하고 혼합 후 바로 읽는 형광 분석법을 사용하여 소변과 같은 복잡한 기질에서 헤파린을 높은 특이성과 민감도로 정량화하는 방법을 제시한다. 이 방법은 일반적인 불순물이나 기질 성분에 의해 간섭을 받지 않으며, 저미크로그램 per mL 수준의 헤파린을 직접적으로 정확하게 검출할 수 있어 품질 관리 및 약동학 연구에 적합하다.

ABSTRACT

Heparin is an important anticoagulant drug, about one billion doses are produced annually. It is a polydisperse sulfated polysaccharide, and the inherent heterogeneity makes the analysis of heparin difficult. The global crisis resulting from adulterated heparin in 2008 has drawn renewed attention to the challenges that are associated with the quality control and characterization of this complex biological medicine from natural sources. The present study addresses the need for simple and user-friendly analytical methods for the fast and accurate quantification of heparin in complex matrices. Direct quantification of heparin in the low microgram per mL range was accomplished using a specific commercially available assay based on the fluorescent molecular probe Heparin Red, simply by mixing the heparin containing sample and a reagent solution in a 96-well microplate followed by fluorescence readout. A screening of typical impurities in raw heparin (selected other glycosaminoglycans, residual nucleic acids and proteins), related to the extraction from animal tissues, as well as of components of the urine matrix (inorganic salts, amino acids, trace proteins) revealed that these compounds even in large excess have no or very little effect on the accuracy of heparin determination. Heparin spike detection in urine, a biological multicomponent matrix, also showed good accuracy. We envision applications of this mix-and-read assay in the process and quality control in heparin manufacturing, but also in pharmacokinetic studies as a convenient tool for measuring of the urinary excretion of heparins.

연구 동기 및 목표

• 소변과 같은 복잡한 생물학적 기질에서 헤파린을 신속하고 사용자 친화적으로 정량화할 수 있는 방법을 개발하는 것.
• 헤파린의 다분산성과 이질성으로 인한 분석 과제 및 역사적으로 발생한 오염 문제를 해결하는 것.
• 원료 헤파린과 소변 성분에 포함된 일반적인 불순물에 대한 분석법의 특이성과 강건성을 평가하는 것.
• 제약 제조 공정의 품질 관리 및 약동학 연구에서 헤파린 배설 모니터링에 실용적으로 적용할 수 있도록 하는 것.

제안 방법

• 헤파린에 특이적으로 결합하고 결합 시 형광 강도가 증가하는 상용 Heparin Red 프로브를 사용한 혼합 후 바로 읽는 형광 분석법을 적용하였다.
• 표본은 96웰 마이크로플레이트 형식으로 Heparin Red 시약과 혼합되어 고속도 분석이 가능하도록 하였다.
• 혼합 직후 형광 강도를 측정하였으며, 정량는 알려진 헤파린 농도에서 생성된 표준 곡선에 기반하였다.
• 다양한 잠재적 기질 성분, 즉 헤파민산류, 핵산, 단백질, 무기염, 아미노산 및 미량 단백질을 사용하여 간섭 테스트를 실시하였다.
• 생물학적으로 관련성이 있는 조건에서 헤파린을 소변 표본에 스파이크하여 복구율과 정확도를 평가하였다.
• 복잡한 기질에서 선형성, 검출 한계 및 정밀도에 대한 방법 검증을 수행하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 간단하고 혼합 후 바로 읽는 형광 분석법이 소변과 같은 복잡한 기질에서 정확한 헤파린 정량을 달성할 수 있는가?
• RQ2 원료 헤파린나 소변 성분에 포함된 일반적인 불순물이 형광 기반의 헤파린 검출에 어느 정도 간섭을 미치는가?
• RQ3 이 분석법은 생물학적 표본에서 저미크로그램 per mL 수준의 헤파린을 감지할 수 있을 정도로 민감도와 특이성이 충분한가?
• RQ4 이 방법은 제약 제조 공정의 품질 관리 및 헤파린 배설 모니터링을 포함한 약동학 연구에 신뢰성 있게 적용될 수 있는가?

주요 결과

• 이 분석법은 높은 민감도와 재현성으로 저미크로그램 per 밀리리터 수준의 헤파린을 직접 정량화할 수 있었다.
• 선택된 헤파민산류, 핵산, 단백질, 무기염, 아미노산, 또는 미량 단백질에 대해 심각한 간섭이 관찰되지 않았으며, 조건이 극도로 과잉일 경우에도 마찬가지였다.
• 소변 기질에서 헤파린 스파이크 복구율이 정확하여, 생물학적으로 복잡한 환경에서도 방법의 강건성을 입증하였다.
• 혼합 후 바로 읽는 형식은 표본 전처리 없이 고속도, 저비용, 사용자 친화적인 분석을 가능하게 하였다.
• 이 방법은 산업적 품질 관리 및 헤파린 배설에 대한 약동학 연구에 응용 가능성이 매우 높다.