[論文レビュー] A solid approach to biopharmaceutical stabilisation

Aswin Doekhie, Rajeev Dattani+9 more|arXiv (Cornell University)|Nov 29, 2018

Monoclonal and Polyclonal Antibodies Research被引用数 5

ひとこと要約

本論文では、生体医薬品の常温保存および輸送を可能にする、タンパク質をシリカでコーティングするソル・ゲル法に基づく「エンシリケーション」を提示する。Tetanus toxoid C fragment (TTCF) がコーティング後も免疫原性を保持していることが示され、SAXS分析により、ナノスケールでのタンパク質-シリカ統合を特徴づける拡散制限クラスターアグリゲーション機構が明らかになった。

ABSTRACT

Ensilication is a technology we developed that can physically stabilise proteins in silica without use of a pre-formed particle matrix. Stabilisation is done by tailor fitting individual proteins with a silica coat using a modified sol-gel process. Biopharmaceuticals, for example, liquid-formulated vaccines with adjuvants, have poor thermal stability. Heating or freezing impairs their potency. As a result, there is an increase in the prevalence of vaccine-preventable diseases in low-income countries even when there are means to combat them. One of the root causes lies in the problematic vaccine cold-chain distribution. We believe that ensilication can improve vaccine availability by enabling transportation without refrigeration. Here, we show that ensilication stabilises tetanus toxoid C fragment (TTCF) and demonstrate that this material can be stored and transported at ambient temperature without compromising the immunogenic properties of TTCF in vivo. TTCF is a component of the diphtheria, tetanus and pertussis (DTP) vaccine. To further our understanding of the ensilication process, and its protective effect on proteins we have studied the formation of TTCF-silica nanoparticles via time-resolved Small Angle X-ray Scattering (SAXS). Our results reveal ensilication to be a staged diffusion-limited cluster aggregation (DLCA) type reaction, induced by the presence of TTCF protein at neutral pH. Analysis of scattering data indicates tailor fitting of TTCF protein. The experimental in vivo immunisation data confirms the retention of immunogenicity after release from silica. Our results suggest that we could utilise this technology for multicomponent vaccines, therapeutics or other biopharmaceuticals that are not compatible with lyophilisation.

研究の動機と目的

• 低資源地域における生体医薬品の保存・輸送中の不安定性という重要な課題に取り組む。
• ワクチンの流通における従来のライオフィライゼーションおよび冷蔵チェーン依存の限界を克服する。
• 事前に形成された粒子を用いない、タンパク質の構造と機能を維持する固体状態安定化法を開発する。
• マルチコンponentワクチンおよび医薬品へのエンシリケーションの実用可能性を実証する。
• 時間分解SAXSを用いて、ナノスケールでのタンパク質-シリカ相互作用の物理的メカニズムを調査する。

提案手法

• 事前に形成された粒子テンプレートを用いずに、個々のタンパク質の周囲に直接シリカマトリックスを形成する、修正されたソル・ゲルプロセスを採用する。
• TTCF-シリカナノ粒子の形成をリアルタイムでモニタリングするため、時間分解小角X線散乱（SAXS）を用いる。
• 中性pHで制御することで、拡散制限クラスターアグリゲーション（DLCA）メカニズムを誘発する。
• タンパク質の水動的体積に正確に適合するようにシリカコーティングを調整し、構造的摂動を最小限に抑える。
• 放出後の免疫原性を、体内での免疫応答実験により確認する。
• 散乱データを分析して、タンパク質-シリカ複合体の成長キネティクスおよび構造的進化を定量する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 エンシリケーションは、TTCFのような生体医薬品を、免疫原性の喪失を伴わず、常温条件下で安定化できるか？
• RQ2 エンシリケーションプロセス中におけるナノスケールでのタンパク質-シリカ相互作用の背後にあるメカニズムは何か？
• RQ3 シリカコーティングは、封入されたタンパク質の構造的完全性および機能にどのように影響を与えるか？
• RQ4 エンシリケーションプロセスは、マルチコンponentワクチンを含む他の生体医薬品にも一般化可能か？
• RQ5 DLCAメカニズムは、タンパク質-シリカナノ粒子の形成をどの程度支配しているか？

主な発見

• 体内での免疫応答実験により、TTCFがシリカに封入され、放出後も完全に免疫原性を保持していることが確認された。
• SAXS分析により、エンシリケーションが中性pH条件下で拡散制限クラスターアグリゲーション（DLCA）メカニズムに従って進行することが明らかになった。
• タンパク質-シリカ界面には、TTCFの水動的体積に適合した適合性が見られ、天然構造が損なわれない。
• 得られたTTCF-シリカナノ粒子は、常温での長期保存後も安定かつ機能を維持したままだった。
• 事前に形成されたシリカ粒子を必要とせず、個々のタンパク質の直接安定化が可能である。
• ライオフィライゼーションに不適合な生体医薬品に対しても適合可能であり、新たな安定化経路を提供する。