[論文レビュー] Bistability of an In Vitro Synthetic Autoregulatory Switch

Pakpoom Subsoontorn, Jongmin Kim+1 more|arXiv (Cornell University)|Jan 4, 2011

Gene Regulatory Network Analysis参考文献 83被引用数 36

ひとこと要約

本研究では、4本のDNA鎖と3種の酵素（T7RNAポリメラーゼ、RNase H、RNase R）を用いて、陽性自己調節を有する合成in vitro DNAスイッチにおける二安定性を示した。スイッチはそのRNA産物を介して自己活性化し、熱力学的に制御されたRNA-DNAハイブリダイゼーションによって安定なオン/オフ状態を達成する。RNase Hが二安定性を実現し、RNase Rが不完全な転写産物を分解することで信号の整合性を保証する。

ABSTRACT

The construction of synthetic biochemical circuits is an essential step for developing quantitative understanding of information processing in natural organisms. Here, we report construction and analysis of an in vitro circuit with positive autoregulation that consists of just four synthetic DNA strands and three enzymes, bacteriophage T7 RNA polymerase, Escherichia coli ribonuclease (RNase) H, and RNase R. The modularity of the DNA switch template allowed a rational design of a synthetic DNA switch regulated by its RNA output acting as a transcription activator. We verified that the thermodynamic and kinetic constraints dictated by the sequence design criteria were enough to experimentally achieve the intended dynamics: a transcription activator configured to regulate its own production. Although only RNase H is necessary to achieve bistability of switch states, RNase R is necessary to maintain stable RNA signal levels and to control incomplete degradation products. A simple mathematical model was used to fit ensemble parameters for the training set of experimental results and was then directly applied to predict time-courses of switch dynamics and sensitivity to parameter variations with reasonable agreement. The positive autoregulation switches can be used to provide constant input signals and store outputs of biochemical networks and are potentially useful for chemical control applications.

研究の動機と目的

• DNAと少数の酵素のみを用いて、陽性フィードバックを有する最小限のin vitro合成自己調節スイッチを設計・構築すること。
• タンパク質ベースの調節因子を用いずに、RNA-DNAハイブリダイゼーションを用いた調節に基づく、合成生化学的回路における二安定性を実証すること。
• スイッチの挙動と信号安定性を支配する動的および熱力学的制約を同定すること。
• ベイズ推論を用いたメトロポリス法によるフィッティングにより、実験的動的挙動を妥当性のある単純な数学的モデルで検証すること。
• このようなスイッチが、合成生化学的ネットワークにおける信号の記憶および化学的制御の実現にどのように応用可能かを検討すること。

提案手法

• スイッチは4本の合成DNA鎖から構成される：プロモーターに挟まれたテンプレート（T-nt）、転写産物（rA）、活性化因子（A）、および阻害因子（dI）で、rAがRNA-DNAハイブリダイゼーションにより自身の転写を活性化する。
• 転写はT7RNAポリメラーゼによって駆動され、RNase HがRNA-DNAハイブリッド内のRNAを切断することでフィードバックが可能になる。RNase Rは残存するRNA断片を分解し、信号ノイズを防ぐ。
• システムはNTPをエネルギー源とする純化されたin vitro環境で動作させ、細胞内マシンとの不測の相互作用を最小限に抑える。
• スイッチのダイナミクスは、時間経過に伴うRNA産物レベルの測定を目的として、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動と蛍光分光法を用いて定量された。
• 11個の速度定数（例：k_T_A、k_M_ON、k_cat_OFF）を有する動的モデルが構築され、メトロポリス法を用いたベイズ推論により実験データにフィットされた。
• 事後分布からパラメータ集合をサンプリングし、スイッチ挙動の予測と濃度変動に対する感受性を評価した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 陽性自己調節を有する最小限のin vitro合成回路が、DNAと少数の酵素のみを用いて二安定スイッチングを達成できるか？
• RQ2 RNase HとRNase Rは、スイッチのオン状態およびオフ状態の実現と安定化において、それぞれどのような役割を果たすか？
• RQ3 アンサンブルパラメータを有する単純な動的モデルが、スイッチのダイナミクスおよびパラメータ感受性をどれほど正確に予測できるか？
• RQ4 DNAおよび酵素の濃度変動が、スイッチの挙動および二安定性にどのように影響を与えるか？
• RQ5 自己活性化スイッチは、合成生化学的ネットワークにおける信頼性の高い信号リピーターまたはメモリ素子として機能できるか？

主な発見

• 自己活性化スイッチは明確な二安定性を示し、初期条件に応じて安定な高レベルおよび低レベルのRNA産物状態が得られ、ゲル電気泳動および蛍光測定により確認された。
• RNase Hは二安定性に不可欠であり、活性化因子rAが形成するRNA-DNAハイブリッドを切断することで、フィードバックループの動作を可能にした。
• RNase Rは不完全な転写産物を分解するために必要であり、誤作動を防ぎ、信号の整合性を保証した。
• ベイズ推論を用いて50個の実験データポイントにフィットした動的モデルは、時間経過に伴うダイナミクスおよびパラメータ感受性を合理的な精度で正確に予測した。
• モデルのパラメータに対する95％信頼区間は、620,000回のMCMC反復後に得られた51個のサンプリングされたパラメータ集合から導出され、予測の妥当性が裏付けられた。
• スイッチの挙動は成分濃度によって調整可能であり、結合ドメインの設計とは独立してスイッチング閾値および出力レベルを調整可能であった。