[論文レビュー] Fluorescence energy transfer enhancement in aluminum nanoapertures

Juan de Torres, Petru Ghenuche+3 more|arXiv (Cornell University)|Apr 3, 2015

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 47被引用数 26

ひとこと要約

本研究は、アルミニウムゼロモード波ガイド（ZMW）におけるフォーラー共鳴エネルギー移動（FRET）を定量的に評価し、FRET率がドナーの崩壊率および局所光学状態密度（LDOS）に線形に比例することを示した。アルミニウムZMWは、緑色領域における損失が低いため、金に比べて蛍光の明るさが向上し、生理的マイクロモル濃度で単一分子FRETを実現可能であり、FRET効率への摂動を最小限に抑えることができる。

ABSTRACT

Zero-mode waveguides (ZMWs) are confining light into attoliter volumes, enabling single molecule fluorescence experiments at physiological micromolar concentrations. Among the fluorescence spectroscopy techniques that can be enhanced by ZMWs, Förster resonance energy transfer (FRET) is one of the most widely used in life sciences. Combining zero-mode waveguides with FRET provides new opportunities to investigate biochemical structures or follow interaction dynamics at micromolar concentration with single molecule resolution. However, prior to any quantitative FRET analysis on biological samples, it is crucial to establish first the influence of the ZMW on the FRET process. Here, we quantify the FRET rates and efficiencies between individual donor-acceptor fluorophore pairs diffusing in aluminum zero-mode waveguides. Aluminum ZMWs are important structures thanks to their commercial availability and the large literature describing their use for single molecule fluorescence spectroscopy. We also compare the results between ZMWs milled in gold and aluminum, and find that while gold has a stronger influence on the decay rates, the lower losses of aluminum in the green spectral region provide larger fluorescence brightness enhancement factors. For both aluminum and gold ZMWs, we observe that the FRET rate scales linearly with the isolated donor decay rate and the local density of optical states (LDOS). Detailed information about FRET in ZMWs unlocks their application as new devices for enhanced single molecule FRET at physiological concentrations.

研究の動機と目的

• 単一分子研究を目的としたフォーラー共鳴エネルギー移動（FRET）に、アルミニウムゼロモード波ガイド（ZMW）が与える影響を定量すること。
• プラズモン効果および光学損失に注目し、アルミニウムZMWと金ZMWの間でFRET効率およびキネティクスを比較すること。
• アルミニウムZMWを、マイクロモル濃度で強化された単一分子FRETの実現可能なプラットフォームとして確立すること。
• ドナー寿命の短縮と蛍光バースト強度解析の2つの独立した方法を用いて、FRET測定を検証すること。
• 局所光学状態密度（LDOS）がプラズモンナノ構造におけるFRET率をどのように制御するかを特定すること。

提案手法

• dsDNAリンクヤー上にドナー・アクセプター蛍光タンパク質を配置し、120〜385 nmの直径を有するアルミニウムおよび金ZMWを用いてFRETを評価した。
• 拡散時間、明るさ、検出体積の低減を測定するために、蛍光自己相関スペクトロスコピー（FCS）を用いた。
• 時間相関単一光子計数（TCSPC）を用いてドナー蛍光の崩壊トレースを測定し、孤立状態およびFRET遮断状態におけるドナー寿命を抽出した。
• 2つの独立した方法を用いてFRETを定量した：(1) エネルギー移動によるドナー寿命の短縮、(2) アクセプターのバースト強度解析。
• FCS自己相関関数をフィッティングして、拡散時間、三重状態分率、点滅時間、蛍光明るさなどのパラメータを抽出した。
• アルミニウムZMWと金ZMWを比較して、蛍光明るさおよび検出体積低減の増幅要因を計算した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 アルミニウムZMWにおける局所光学状態密度（LDOS）は、FRET率および効率にどのように影響するか？
• RQ2 プラズモン金属の選択（アルミニウム対金）が、FRET効率および蛍光明るさの増幅に与える影響は何か？
• RQ3 ZMWは、従来の共焦点顕微鏡と比較して、FRETプロセスにどの程度の摂動を及えるか？
• RQ4 非放射的損失に注目した場合、アルミニウムZMWにおける蛍光崩壊ダイナミクスは、金ZMWと比較してどのように異なるか？
• RQ5 2つの独立した方法を用いたFRET測定は信頼性があり、一貫性のある結果をもたらすか？

主な発見

• アルミニウムZMWにおけるFRET率は、孤立状態のドナー崩壊率および局所光学状態密度（LDOS）の両方に線形に比例し、理論的予測を裏付けた。
• 190 nmの直径において、アルミニウムZMWは3.3倍の蛍光明るさ増幅を示し、金の1.5倍よりも顕著に高い。これは、緑色領域における光学損失が低いことに起因する。
• FRET効率は、さまざまなZMWの直径および濃度（最大4倍）においてほとんど変化せず、N ≈ 16に達するまで顕著なずれは観察されず、空間平均化効果が最小限であることが示された。
• アルミニウムZMWにおけるドナー蛍光寿命は、共焦点測定の約3.0 nsから、FRETペアでは約1.5–2.0 nsに短縮され、エネルギー移動効率が約50%であることに一致する。
• 金ZMWでは、金の光励起発光に起因する速やかな（約5 ps）補助的崩壊成分が観察されたが、アルミニウムZMWには同様の成分が認められなかった。
• プラズモン金属の性能指標（|Re(ε)|/|Im(ε)|）は、アルミニウムが560 nm付近の緑色領域で金を上回り、虚部が小さいため損失が低減される。