[論文レビュー] FTIR spectral imaging as a probe of ultrasound effect on cells in vitro

Lucia Di Giambattista, Paola Grimaldi+6 more|Jul 6, 2010

Spectroscopy Techniques in Biomedical and Chemical Research参考文献 18被引用数 7

ひとこと要約

本研究は、FTIRスペクトルイメージングおよび接着阻止マイクロニュクレウス（CBMN）アッセイを用いて、パルス1 MHz治療用超音波がNIH-3T3マウス線維芽細胞に及ぼす生化学的および遺伝毒性効果を調査した。得られた結果は、試験条件下で有意なDNA損傷や突然変異が認められなかったことを示し、非腫瘍性細胞において超音波による細胞膜貫通（ソノポレーション）が安全であることを示している。

ABSTRACT

Safe and efficient intracellular delivery of genes or drugs is critically important in targeted cancer treatment and gene therapy applications. Ultrasound (US) has been demonstrated to alter the cell membrane permeability due to a biophysical mechanism (Sonoporation) and exploited as a promising non-invasive gene transfer method. The sonoporation process could induce the formation of transient pores without significantly affecting cell viability. This research is aimed at investigating some bioeffects due to Therapeutic Ultrasound (pulsed-1 MHz) which could allow to enhance drugs or genes delivery in a non tumoral cell line. We have used the NIH-3T3 cell line as model system and exposed it to US at two different distances from the source; the effects of this pulsed ultrasonic wave on cells were assessed by Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopic imaging analysis. This technique combined with a focal plane array (FPA) detector has been widely used to study the general biochemical changes in vitro; moreover, the development of FPA detectors and shortening of measurement times specifically for IR imaging, from several hours to few minutes, have made possible to image the distribution of molecular species in biological samples. We have also performed a cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay to reveal the presence or not of micronuclei (named Howell-Jolly bodies) formed during the cell division due to the DNA damage. The results of IR analysis combined with the cytogenetic analysis have shown that these experimental conditions can not cause DNA mutations in the NIH-3T3 cell line. Finally, the comparison between the spectral parameters of the average spectrum extracted from the spectral map and those of the set of all spectra from the spectral map could be limited by the presence of bad pixels inside the map.

研究の動機と目的

• 非腫瘍性細胞における非侵襲的細胞内送達を目的としたパルス1 MHz治療用超音波の安全性を評価すること。
• 超音波被曝が細胞のDNA安定性に及ぼす潜在的遺伝毒性効果を調査すること。
• FTIRスペクトルイメージングを用いて、超音波処理後の細胞における分子レベルの生化学的変化を検出すること。
• FTIRスペクトルデータと細胞遺伝学的分析を照合し、超音波誘発ストレスの包括的評価を行うこと。
• 制御された条件下で、超音波被曝がNIH-3T3細胞に突然変異や染色体異常を誘発するかどうかを特定すること。

提案手法

• NIH-3T3細胞を、超音波発生源からの2種類の距離でパルス1 MHz超音波に暴露する。
• 焦点面アレイ（FPA）検出器を備えたフォーリエ変換赤外分光法（FT-IR）スペクトルイメージングを用いて、細胞内の分子分布をマッピングする。
• 個々の細胞からのスペクトルマップを取得し、タンパク質、脂質、核酸における生化学的変化を評価する。
• スペクトルマップの平均スペクトルと全スペクトルセットを比較し、不良ピクセルに起因するアーティファクトを検出する。
• マイクロニュクレウス形成をDNA損傷のバイオマーカーとして検出するため、接着阻止マイクロニュクレウス（CBMN）アッセイを実施する。
• FTIRおよびCBMNデータを統合し、超音波被曝に起因する分子的および遺伝毒性効果を評価する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 パルス1 MHz超音波は、FTIRスペクトルイメージングで測定した場合、NIH-3T3細胞に検出可能な生化学的変化を誘発するか？
• RQ2 NIH-3T3細胞における超音波被曝後に、DNA損傷やマイクロニュクレウス形成といった顕著な遺伝毒性効果が認められるか？
• RQ3 FTIRスペクトルイメージングは、細胞毒性を引き起こさずに、ソノポレーションに関連する分子的変化を同定できるか？
• RQ4 平均スペクトルからのスペクトルパラメータと全スペクトルマップからのパラメータを比較すると、その差異は何かを示唆するか？
• RQ5 染色体の安定性および細胞生存率の観点から、非腫瘍性細胞に対してこの超音波被曝プロトコルは安全であるか？

主な発見

• CBMNアッセイによる結果、超音波被曝後もNIH-3T3細胞に有意なDNA損傷は認められず、マイクロニュクレウスの存在が確認されなかった。
• FTIRスペクトルイメージングにより、試験された超音波条件下でタンパク質、脂質、核酸に顕著な生化学的変化は認められなかった。
• 平均スペクトルと全スペクトルマップのパラメータの比較から、不良ピクセルに起因するアーティファクトの可能性が示され、データ解釈における制限を浮き彫りにした。
• FTIRおよびCBMN解析の統合により、使用した超音波パラメータが突然変異や染色体不安定性を誘発しなかったことが確認された。
• 結果は、パルス1 MHz超音波が非腫瘍性細胞ラインにおける非侵襲的遺伝子および薬物送達に安全であることを支持する。
• FPAを用いたFTIRイメージングにより、測定時間を数時間から数分に短縮できる高速で高分解能の分子マッピングが可能になった。