[論文レビュー] Leveraging massively parallel reporter assays for evolutionary questions

Irene Gallego Romero, Amanda J. Lea|arXiv (Cornell University)|Apr 12, 2022

Genetic diversity and population structure被引用数 6

ひとこと要約

本論文は、系統的変化における非コーディング調節配列の役割を解明するために、大規模並列レポーター・アッセイ（MPRA）の使用を提唱している。MPRAは、一度の実験で数千～数百万の調節配列を高スループットで機能的テスト可能であり、従来の手法に見られるスケーラビリティや非モデル生物への適用性の制限を克服する。これにより、ゲノムスケールの機能的進化遺伝学に強力なツールが提供される。

ABSTRACT

A long-standing goal of evolutionary biology is to decode how gene regulatory processes contribute to organismal diversity, both within and between species. This question has remained challenging to answer, due both to the difficulties of predicting function from non-coding sequence, and to the technological constraints of laboratory research with non-model taxa. However, a recent methodological development in functional genomics, the massively parallel reporter assay (MPRA), makes it possible to test thousands to millions of sequences for regulatory activity in a single in vitro experiment. It does so by combining traditional, single-locus episomal reporter assays (e.g., luciferase reporter assays) with the scalability of high-throughput sequencing. In this perspective, we discuss the execution, advantages, and limitations of MPRAs for research in evolutionary biology. We review recent studies that have made use of this approach to address explicitly evolutionary questions, highlighting study designs that we believe are particularly well-positioned to gain from MPRA approaches. Additionally, we propose solutions for extending these powerful assays to rare taxa and those with limited genomic resources. In doing so, we underscore the broad potential of MPRAs to drive genome-scale functional evolutionary genetics studies in non-traditional model organisms.

研究の動機と目的

• 進化生物学における非コーディングDNA配列と調節機能の関連を解明する課題に対処すること。
• ゲノムリソースが限られる非モデル分類群における調節要素のテストにおける技術的制限を克服すること。
• MPRAを用いて進化的な問いに答えるために、機能的アッセイをゲノムワイドレベルにスケールアップすること。
• ゲノムリソースが乏しい希少または十分に特徴付けられていない種にMPRAを適用するための実用的解決策を提示すること。
• MPRAを、従来のモデル生物にとどまらない大規模で機能的な進化遺伝学の分野における変革的ツールとして位置づけること。

提案手法

• エピソーマルレポーター系と高スループットシークエンシングを組み合わせた、大規模並列レポーター・アッセイ（MPRA）を活用する。
• 多様な種から得た数千～数百万の非コーディングDNA配列を含む合成ライブラリを設計する。
• MPRAを次世代シークエンシングと統合し、一度のin vitro 実験で各配列バリアントの転写活性を定量する。
• 保存された調節機構と種間適合性を活用することで、非モデル生物へのMPRAプロトコルの適応を図る。
• MPRAリードカウントを調節機能の強さの代理指標として正規化・解釈するためのバイオインフォマティクスパイプラインを統合する。
• トランスフェクションと合成プロモーター設計を活用し、遺伝的ツールが乏しい分野へのMPRA適用戦略を提言する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 非モデル生物由来の調節配列を、進化的役割を理解するためにスケールアップして機能的テストするにはどうすればよいか？
• RQ2 進化的研究において感度と再現性を最大化するためのMPRA実験の主な設計原則は何か？
• RQ3 ゲノム的・分子的リソースが乏しい希少または十分に特徴付けられていない種にMPRAをどのように適応できるか？
• RQ4 MPRAデータは、進化的に分岐した系統の間でcis-調節活性をどの程度正確に予測できるか？
• RQ5 MPRAを比較ゲノム学と統合することで、進化的文脈における機能的に重要な非コーディングバリアントをどのように同定できるか？

主な発見

• MPRAは、一度の実験で数万～数百万の調節配列の機能的テストが可能であり、従来のレポーターアッセイに比べて大幅にスループットが向上する。
• MPRAデータはモデル系における内因性遺伝子発現パターンと強く相関しており、調節要素同定に向けた有効性が裏付けられる。
• トランスフェクション条件の最適化と保存されたプロモーター要素の使用により、非モデル生物への適用が可能である。
• MPRAは、系統を超えた相同調節配列間の微細な機能的差異を検出でき、遺伝子調節における進化的変化を明らかにする。
• MPRAを比較ゲノム学と組み合わせることで、進化的分析のための機能的に重要な非コーディングバリアントを優先的に特定できる。
• 著者らは、ゲノム的・分子的リソースが乏しい分野へのMPRA適用に向けた実現可能なワークフローを提言し、モデル系を超えたその応用範囲を拡大している。