[論文レビュー] Pore lifetimes in cell electroporation: Complex dark pores?

James C. Weaver, P. Thomas Vernier|arXiv (Cornell University)|Aug 24, 2017

Microbial Inactivation Methods参考文献 18被引用数 11

ひとこと要約

この論文は、電穿朒における一時的で完全にリン脂質から成る孔の長年のモデルに挑戦し、分子動力学的シミュレーションの結果、このような孔がパルス後約2 μs以内に消滅することを主張している。代わりに、長期間にわたり存続する複雑な孔——リン脂質と他の分子から構成される——が、パルス後に持続するイオンおよび分子輸送を担っていると提唱する。これらの孔は構造的に未知（「ダーク」）であるが、長期間にわたる寿命（最大数秒）を示す実験的証拠が提示されている。

ABSTRACT

We review some of the basic concepts and the possible pore structures associated with electroporation (EP) for times after electrical pulsing. We purposefully give only a short description of pore creation and subsequent evolution of pore populations, as these are adequately discussed in both reviews and original research reports. In contrast, post-pulse pore concepts have changed dramatically. For perspective we note that pores are not directly observed. Instead understanding of pores is based on inference from experiments and, increasingly, molecular dynamics (MD) simulations. In the past decade concepts for post-pulse pores have changed significantly: The idea of pure lipidic transient pores (TPs) that exist for milliseconds or longer post-pulse has become inconsistent with MD results, which support TP lifetimes of only $\sim$100 ns. A typical large TP number during cell EP pulsing is of order $10^6$. In twenty MD-based TP lifetimes (2 us total), the TP number plummets to $\sim$0.001. In short, TPs vanish 2 us after a pulse ends, and cannot account for post-pulse behavior such as large and relatively non-specific ionic and molecular transport. Instead, an early conjecture of complex pores (CPs) with both lipidic and other molecule should be taken seriously. Indeed, in the past decade several experiments provide partial support for complex pores (CPs). Presently, CPs are "dark", in the sense that while some CP functions are known, little is known about their structure(s). There may be a wide range of lifetimes and permeabilities, not yet revealed by experiments. Like cosmology's dark matter, these unseen pores present us with an outstanding problem.

研究の動機と目的

• 最新の分子動力学的（MD）シミュレーションを用いて、電穿朢パルス後のリン脂質孔の持続性を再評価すること。
• 実験的に観察された長期間にわたるパルス後膜透過性と、完全にリン脂質から成る孔のMDによる予測寿命（約100 ns）との矛盾を解消すること。
• リン脂質と他の分子からなる複雑な孔が、直接的な構造的同定ができないにもかかわらず、持続的透過性の背後にある可能性を提唱すること。
• 実験的およびシミュレーション的証拠を統合し、完全にリン脂質でないが、長期間にわたって機能的な輸送経路を形成する孔の存在を示唆すること。

提案手法

• 完全にリン脂質から成る孔の崩壊に顕著な自由エネルギー障壁がないことを示すMDシミュレーションの解析により、急速な孔の収縮が予測される。
• MDで予測された一時的孔（TP）の寿命（約100 ns）と、実験的パルス後回復時間（最大180 s）を比較し、矛盾を特定する。
• プレーンバイレイヤー、細胞、パルス列実験からの実験データを統合し、数秒のスケールで遅延を伴う透過性と再封鎖を示す。
• 電導度、イオンフラックス（Ca²⁺、プロピジウム）、カルセイン放出測定を用いて、パルス後の孔の挙動を推定する。
• 0.1 sの間隔をあけるパルス列実験を用い、孔の回復および再形成を推論する。
• 電気生理学的および溶質輸送データの解釈により、長期間にわたる非拡散的輸送経路の存在を推論する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 なぜ実験的測定では電穿朢パルス後、MDシミュレーションで予測される一時的孔の寿命（約100 ns）よりもはるかに長い時間（数秒）にわたって膜透過性が持続するのか？
• RQ2 完全にリン脂質から成る一時的孔の予測寿命（約2 μs）を超えて持続する孔が、どのような構造的・エネルギー的特徴を持つ可能性があるのか？
• RQ3 MDシミュレーションでリン脂質孔が検出されないにもかかわらず、実験的観察で得られる再封鎖時間スケール（最大180 s）は、どのように説明できるのか？
• RQ4 長期間にわたる透過性を媒介する非リン脂質的で複雑な孔構造の存在を裏付ける証拠は何か？
• RQ5 活性輸送機構や電気泳動効果が、パルス後の溶質輸送に寄与する程度はどの程度か？これにより、安定した孔様構造の存在が示唆されるか？

主な発見

• 分子動力学的シミュレーションにより、完全にリン脂質から成る一時的孔には、破壊に顕著な自由エネルギー障壁がないことが示され、予測される寿命は約100 nsで急速な収縮が生じる。
• 約10⁶個の孔が約0.001個に減少するまでの総時間は約2 μsと推定され、パルス後数マイクロ秒以内に完全に消失することが示唆される。
• 膜の再封鎖および回復時間スケールの実験的測定値は、0.01 sから180 sまで変動し、完全にリン脂質から成る孔の予測寿命をはるかに上回る。
• 0.1 sの間隔をあけるパルス列実験では、新しい孔が形成されることから、孔の数および膜電導度が100 ms以内に著しく回復することが示唆される。
• パルス後100～1800 sの間に透過性の増加が遅延して観察され、長期間にわたる非拡散的輸送経路の存在を示唆する。
• 静止状態の電位下での溶質輸送の証拠から、拡散および電気泳動の両方が輸送に寄与することが示され、一時的孔の寿命をはるかに超えて持続する安定した長期間にわたる孔様構造の存在が示唆される。