[論文レビュー] Quantized Dehydration and the Determinants of Selectivity in the NaChBac Bacterial Sodium Channel

O. A. Fedorenko, Igor Khaimovich Kaufman+4 more|arXiv (Cornell University)|Mar 19, 2018

Ion channel regulation and function参考文献 40被引用数 5

ひとこと要約

本研究は、細菌性ナトリウムチャネルNaChBacにおけるイオン選択性を説明するため、量子化された脱水によるイオンコロンブブロッキング（ICB/QD）モデルを提唱する。サイト指向的突然変異、全細胞パッチクラム記録、理論的モデリングを組み合わせることで、選択性フィルターにおける有効固定電荷 $Q_{f}^{*}$ ——プロトン化によって低減される——が、選択性のシフトを決定し、生物学的イオンチャネルにおけるICBオシレーショングの初回実験的観察を可能にした。

ABSTRACT

A discrete electrostatic/diffusion model has been developed to describe the selective permeation of ion channels, based on ionic Coulomb blockade (ICB) and quantised dehydration (QD). It has been applied to describe selectivity phenomena measured in the bacterial NaChBac sodium channel and some of its mutants. Site-directed mutagenesis and the whole-cell patch-clamp technique were used to investigate how the value $Q_f$ of the fixed charge at the selectivity filter (SF) affected both valence and alike-charge selectivity. The new ICB/QD model predicts that increasing ${Q_f}$ should lead to a shift of selectivity sequences towards larger ion sizes and charges, a result that agrees with the present experiments and with earlier work. Comparison of the model with experimental data provides evidence for an {\it effective charge} $Q_f^*$ at the SF that is smaller in magnitude than the nominal $Q_f$ corresponding to the charge on the isolated protein residues. Furthermore, $Q_f^*$ was different for aspartate and glutamate charged rings and also depended on their position within the SF. It is suggested that protonation of the residues within the restricted space is an important factor in significantly reducing the effective charge of the EEEE ring. Values of $Q_f^*$ derived from experiments on the anomalous mole fraction effect (AMFE) agree well with expectations based on the ICB/QD model and have led to the first clear demonstration of the expected ICB oscillations in Ca$^{2+}$ conduction as a function of the fixed charge. Pilot studies of the dependence of Ca$^{2+}$ conduction on pH are consistent with the predictions of the model.

研究の動機と目的

• 細菌性NaChBacチャネルにおけるイオン選択性の物理的起源を解明すること、特に選択性フィルターにおける名目固定電荷と機能的固定電荷の不一致に焦点を当てる。
• 固定電荷（$Q_f$）と残基の性質（Asp対Glu）を変更する突然変異が、バリエンス選択性および同種電荷選択性に与える影響を調査すること。
• イオンコロンブブロッキングと量子化された脱水（ICB/QD）モデルの予測を、電導度および異常モル分率効果（AMFE）に関する実験データと照合して検証すること。
• 有効電荷 $Q_f^*$ ——プロトン化および電気的スクリーニングを考慮したもの——が、名目電荷 $Q_f$ よりも実験的Eisenman系列およびCa²⁺ブロッキング閾値をよりよく説明できるかどうかを特定すること。

提案手法

• 位置191および192における固定電荷（$Q_f^{nm}$）を体系的に変化させたNaChBac突然変異体（例：E191D、S192K、S192E）を、サイト指向的突然変異によって作成した。
• 全細胞パッチクラム電気生理学を用いて、Na⁺/Ca²⁺電導度および2価イオンブロッキング閾値を突然変異体間で測定した。
• ICB/QDモデルを構築・適用し、イオンコロンブブロッキングと量子化された脱水を統合して、$Q_f^*$ の関数としてのイオン透過および選択性を予測した。
• AMFEデータから有効電荷 $Q_f^*$ を計算し、モデル予測と照合することで、ICB/QDフレームワークの妥当性を検証した。
• pH依存性実験を実施し、特にD-およびE-リング突然変異体における $Q_f^*$ へのプロトン化効果を調査した。
• 実験結果をICB電導度対 $Q_f^*$ 曲線にマッピングし、ブロッキング点および共鳴電導点（例：$Z_1$、$M1$、$Z_2$）を特定した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 NaChBacの選択性フィルターにおける有効固定電荷 $Q_f^*$ は、名目電荷 $Q_f$ とどのように異なり、その低減の原因は何か？
• RQ2 ICB/QDモデルの予測通り、$Q_f^*$ を増加させると、Eisenman選択性系列がより大きなイオン半径およびより高い価数へシフトするか？
• RQ3 同一の名目 $Q_f$（例：-4 または -8）を持つが、残基の性質が異なる突然変異体（Asp 対 Glu）が、なぜ異なる透過プロファイルを示すのか？
• RQ4 ICB/QDモデルは、NaChBac突然変異体における異常モル分率効果（AMFE）および2価イオンブロッキングを説明できるか？
• RQ5 生物学的イオンチャネルに、イオンコロンブブロッキング（ICB）オシレーショングの実験的証拠があるか？また、それらは $Q_f^*$ と相関するか？

主な発見

• 選択性フィルターにおける有効固定電荷 $Q_f^*$ は、名目電荷 $Q_f$ よりも著しく小さく、強い電気的スクリーニングまたはプロトン化効果を示唆している。
• 同一の名目 $Q_f$ でも、残基の性質が異なる（例：E191D 対 S192E）突然変異体では、$Q_f^*$ が異なり、アスパラギン酸環はグルタミン酸環よりも低い有効電荷を示した。
• ICB/QDモデルは、$Q_f^*$ を増加させるとEisenman選択性系列がより大きなイオン半径および高価数へシフトするという予測を成功裏に再現し、実験観察と一致した。
• LDEWAS突然変異体では、明確な $Z_2 \to -4e$ Ca²⁺コロンブブロッキング点が観察され、LEDWAS突然変異体では共鳴電導点 $M1 \to -3e$ が確認された。これにより、生物学的イオンチャネルにおけるICBオシレーショングの初回実験的証明が得られた。
• LESWAS突然変異体では、$Z_1 \to -2e$ ブロッキング点が観察され、pHに依存しなかった。これは、ICBマップにおけるCa²⁺ストップバンド内に位置するとの一貫性を示した。
• LDSWAS突然変異体では、pH依存的にCa²⁺電流が低下したが、これはICBモデルの予測とは一致せず、プロトン化ダイナミクスまたは構造的変化のさらなる調査が求められることが示唆された。